随着人类社会的发展，越来越多的化学致癌物进入人们的生活，目前致癌物的检测方法存在很多不足，促使人们寻找更加敏感、特异、快速的检测方法。细胞转化试验作为一种化学致癌物检测模型越来越受到人们的重视。 通过人为改变人原代细胞中一些癌基因或抑癌基因的表达，能使其逃脱老化而获得永生化。尽管这些永生化细胞获得了无限增殖的能力，但没有获得恶性细胞的表型，在永生化的细胞中继续导入其他的癌基因，最终使细胞发生恶性转化。在转化前的阶段，细胞并没有恶性表型，而是处于逐渐发牛转化的易感状态，处于此阶段的细胞在致癌因素作用下比正常的永生化细胞更容易发生转化。因此，我们选取处于转化前期易感阶段的细胞作为模型，来检测致癌物的致癌活性。 本课题组已经证实，处于易感状态的细胞(高表达H-RasV12和c-Myc的永生化呼吸道上皮细胞)对直接致癌物的敏感性比正常细胞高。说明此细胞转化模型对于直接致癌物的检测有很高的灵敏度。而环境中除了直接致癌物外，绝大部分是间接致癌物，必须经过代谢活化才具有致癌活性。所以细胞转化模型中必须包括一个代谢系统来活化间接致癌物。目前，在致癌活性检测中，S9虽然是经典的代谢系统，但存在很多不足。与S9相比，细胞内的活化系统代谢能力更强，弥补了S9的很多不足。细胞内代谢包括在细胞中高表达特异性代谢酶和诱导特异性代谢酶的表达。 我们选择永生化人肝细胞，导入第12密码子突变的H-Ras癌基因，使其处于恶性转化前的易感状态。采用三种代谢系统：高表达CYP1A2，底物诱导CYP1A2的高表达和S9，选择具有代表性的间接致癌物黄曲霉毒素B1(Aflotoxin B1，AFB1)作用于永生化和转化前期细胞株，通过软琼脂克隆形成试验和裸鼠皮下成瘤试验验证在代谢系统的活化下，间接致癌物诱导细胞转化的作用，探讨活化系统在人细胞转化模型中应用的可行性，为间接化学诱变物和致癌物的检测提供稳定、操作简便、灵敏度高、特异度好和更接近人体的活化系统。 研究方法： 1.1 RAS高表达细胞株L02-R和ST高表达细胞株L02-RST的建立利用逆转录病毒载体介导的方法在人永生化肝细胞L02的基础上构建癌基因H-RasV12(V12，第12密码子突变)高表达的细胞株L02-R，免疫印迹检测RAS蛋白的表达。为了提供与L02-R基因背景接近的阳性对照细胞，L02-R中导入SV-40的小T抗原(SV 40 small antigen，ST)。通过绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表达检测ST的蛋白表达。通过形态学观察、绘制生长曲线以及恶性转化试验观察所构建细胞株的生物学特性。 1.2.三种代谢系统的建立和评价 1.2.1 S9代谢活化系统的制备和检测多氯联苯(Polychlorinated biphenyls，PCBs)诱导大鼠，常规方法制备S9，BCA法测定S9的蛋白含量，Ames试验测定S9的代谢活性。 1.2.2高表达CYP1A2细胞株的建立用BamHI和XhoI酶切pCR2.1-ToPo-CYP1A2，得到CYP1A2，连接到逆转录病毒载体pMIG上，获得pMIG-CYP1A2质粒。用逆转录病毒pMIG-CYP1A2表达载体在L02-R的基础上建立高表达CYP1A2的细胞株L02-RA。免疫印迹测定CYP1A2蛋白的表达，P450-GLOTM试剂盒测定CYP1A2的酶活性。 1.2.3 AFB1对L02细胞中CYP1A2的诱导效应用0.1μM AFB1诱导48小时后换成新鲜培养基继续维持培养到96小时，分别在诱导的24、48、72和96小时测定CYP1A2的表达，来确定诱导效应最强的时间点。用免疫印迹测定CYP1A2的表达，P450-GLOTM试剂盒测定CYP1A2的酶活性。 1.3AFB1诱导细胞转化实验 1.3.1 AFB1染毒浓度的确定： 在相同的染毒浓度下，测定三种代谢系统活化AFB1所引起的细胞毒性。选择其中毒性最大的IC50的50％、20％和5％作为染毒剂量。 1.3.2细胞转化试验每周染毒一次，连续染毒四次。染毒后第5周开始每隔两周做一次软琼脂试验，直至阳性结果出现；连续两次软琼脂试验出现阳性结果后进行裸鼠皮下成瘤试验。 结果： 2.1 RAS和ST高表达细胞株的建立免疫印迹检测RAS蛋白表达的结果显示L02-R的RAS表达比对照细胞升高约5倍。L02-RST荧光蛋白的表达效率较高，达到80％。与L02相比，L02-R和L02-V在形态上没有明显改变。L02-RST细胞体积变大，失去了原来的多角形形态，出现局部重叠生长的现象，提示细胞已经失去正常的接触抑制，出现恶性表型。L02-V和L02-R的生长速度比较接近，L02-RST的生长速度最快。软琼脂试验结果显示，L02-V、L02-R偶见克隆形成；而L02-RST形成较多克隆。裸鼠试验结果显示L02、L02-V和L02-R在接种后3个月内均未能在裸鼠皮下形成肿瘤；而L02-RST则在接种后第10天长出肉眼可见的肿瘤。 2.2三种代谢系统的建立和评价 2.2.1 S9代谢系统的建立Ames试验检测S9的活性的结果说明S9能够代谢间接致癌物。 2.2.2高表达CYP1A2细胞株的建立免疫印迹测定结果显示L02-RA中CYP1A2的表达结果比对照升高约5倍。酶活性的测定结果与免疫印迹的结果一致。与对照细胞相比，L02-RA和L02-VA在形态学上未见明显改变，CYP1A2的导入并未影响细胞的生长形态。L02-RA和L02-R细胞的倍增时间分别是33.53小时和34.85小时，提示CYP1A2导入对L02R细胞的生长速度影响不大。L02-VA、L02-RA的软琼脂实验和裸鼠实验的结果均为阴性。 2.2.3 AFB1诱导L02细胞CYPIA2的高表达免疫印迹测定AFB1诱导L02细胞CYP1A2的高表达，结果显示CYP1A2蛋白的表达于诱导48小时达到高峰，当撤掉AFB1后，CYP1A2蛋白的表达开始下降，但于72和96小时仍可观察到明显的CYPlA2表达。酶活性测定的结果显示，AFB1能够诱导CYP1A2的表达，并且有剂量反应关系。 2.3.AFB1诱导细胞转化实验 2.3.1染毒浓度的确定S9活化AFB1后，引起的细胞毒性最强。根据抑制率和浓度的回归方程计算S9活化AFB1的IC50是0.64μM，不加活化系统时，AFB1的IC50是5.24μM。根据有S9活化时AFB1的半数抑制浓度IC50确定三种活化系统的染毒浓度为0.3μM、0.1μM和0.03μM。 2.3.2细胞转化试验： (1)AFB1经三种代谢系统活化后均可诱导高表达RasV12的细胞株在不同的时间发生转化，在染毒20周内均未能诱导对照细胞L02-V发生转化。 (2)未加代谢系统的条件下，经AFB1染毒的L02-R在第17周发生转化：而加入S9时，在第8周发生转化，比L02-R缩短了9周；经0.1μMAFB1诱导和高表达CYP1A2均使转化问期缩短6周，于第11周发生转化。 (3)细胞转化的效应与AFB1有剂量和时间效应关系。 结论： 1.成功构建了癌基因H-RasV12和P450 CYP1A2稳定高表达的转基因细胞株。所构建的细胞株在生长形态、生长速度、锚着独立性生长等生物学特性未发生明显改变，没有获得恶性转化的表型。在高表达H-Ras的基础上继续导入SV40 ST能诱导细胞发生恶性转化。 2.三种代谢系统：大鼠肝微粒体组份S9、AFB1低剂量诱导和细胞高表达CYP1A2都能够促进间接致癌物AFB1的代谢活化，缩短细胞转化的时间，提高细胞转化效率。 3.从试验操作难度、试验的重复性、试验结果的可靠性等几个方面比较三种代谢系统应用的可行性，与传统的S9代谢活化系统相比，低剂量诱导作为新的代谢活化的方法在细胞转化试验中有着良好的应用前景。