神经系统遗传病是所有遗传病中最为重要的一类,是神经系统疾病和医学遗传学的重要组成部分。神经系统遗传病病种繁多。在目前所发现的五千多种单基因病中,累及神经系统的约占一半,其中以神经系统症状体征为主要临床表现的约有300多种。神经遗传病大都具有家族性和终身性的特点,不少疾病的病因和发病机制尚未阐明。大多数神经系统遗传病患者在30岁前出现症状。神经系统遗传病大多数目前尚无有效的治疗方法,其致残率、致死率高,故多数神经系统遗传病预后不良。近十年来,神经遗传病在致病基因定位、克隆及基因诊断和治疗等方面取得了突破,推动了神经遗传病研究的发展。遗传性痉挛性截瘫是一组具有明显临床及遗传异质性的神经系统遗传病,临床上以进行性双下肢肌张力增高和肌无力为主要特征。遗传性痉挛性截瘫的病理改变以上运动神经元的轴索变性和脱髓鞘为主,主要累及脊髓内长的上、下行纤维束(皮质脊髓束及背束),特别是这些纤维束的远端。Charcot-Marie-Tooth病也被称为遗传性运动感觉周围神经病,是一组遗传异质性非常强的周围神经系统的神经遗传病。遗传性运动感觉周围神经病与遗传性痉挛性截瘫类似,同属于累及神经轴索的神经遗传病,病理改变也以神经轴索的脱髓鞘和变性为主。二者的区别在于遗传性痉挛性截瘫主要累及的是上运动神经元的轴索,而Charcot-Marie-Tooth病主要累及下运动神经元的轴索,同时感觉神经也受累。遗传性痉挛性截瘫和Charcot-Marie-Tooth病在发病机制上存在着交叉重叠之处,研究这两种神经遗传病的发病机制对于理解神经轴索正常功能的维持具有重要的意义。在本研究中,我们利用在山东采集到的两个大家系,对上述两种神经遗传病进行了分子遗传学的研究,分离了相关的致病基因。相关致病基因的分离和鉴定,为揭示上述疾病的发病机制奠定了基础。同时,我们还能够为患者提供产前诊断服务,预防患儿出生,提高人口素质。论文中提到的两个神经遗传病家系具有人数多、现症者多的特点,它们的保护与采集无疑为这两种神经遗传病的病因机制研究提供了宝贵、翔实的研究材料。第一部分一常染色体显性遗传性痉挛性截瘫大家系的家系调查及临床分析我们在遗传咨询中收集到一个来自山东青岛地区的遗传性痉挛性截瘫的大家系。该家系共有五代,我们采集到45名家系成员的血样,包括23名患者,其中具有遗传性痉挛性截瘫典型症状的患者20名,表现轻微的患者3名。家系中还有携带者1名。所有家系成员的血样提取成DNA保存备用。该家系中男女均有发病,男性患者略多于女性。家系中连续儿代均有发病患者,在连续世代中呈垂直分布,家系中存在不完全外显现象。通过系谱分析,该遗传性痉挛性截瘫家系的遗传方式为常染色体显性遗传,同时伴有不完全外显现象。经过详细的临床调查,该遗传性痉挛性截瘫家系临床特点总结如下：①发病年龄差异较大；②病情进展缓慢；临床症状差异也较大,家系中还有完全不表现症状的携带者；③无遗传早现现象；④主要表现为双下肢痉挛性截瘫；⑤头部MRI、肌电图和肌肉活检无明显异常；根据遗传性痉挛性截瘫的诊断标准,可以确诊此家系为单纯型遗传性痉挛性截瘫。第二部分一个新的遗传性痉挛性截瘫致病基因定位获得以上大家系后,我们首先采用连锁分析的方法,对已知的11个单纯型常染色体显性遗传性痉挛性截瘫基因位点进行了分析。我们分别在这11个位点附近选择紧密连锁的微卫星DNA多态位点,通过对微卫星DNA多态位点进行基因分型和计算LOD score值,排除了这些位点是我们所发现的大家系的致病基因的可能,提示该家系为一个新的单纯型常染色体显性遗传性痉挛性截瘫位点。随后,我们采用全基因组扫描的方法定位该家系致病基因。在全基因组扫描过程中,选取了家系中明确诊断的患者、轻症患者、携带者和正常配偶共24名成员,分别对22条常染色体上的205个微卫星DNA多态位点进行分型,平均间距为15-20cM。通过全基因组扫描,我们发现了6个LOD值阳性的微卫星DNA多态位点,分别分布于3、4、6、7和20这5条染色体上。通过验证,位于3号染色体D3S1744附近区域与在该家系中与疾病表型共分离,其他位点为假阳性。我们在D3S1744位点所在的区域附近,从Marshfield数据库中选择了11个微卫星DNA多态位点进行精细定位。我们通过全基因组扫描、精细定位和单体型分析,最终将该遗传性痉挛性截瘫家系的致病基因定位于染色体3q24-3q26区域上D3S2326与D3S3053之间约22cM的范围内。其中,在D31746得到最大LOD值5.085(θ=0),D3S1545得到仅次于它的LOD值5.069,证实了该染色体区域在家系中与疾病共分离。我们所定位的新型SPG致病基因位点,HUGO命名为SPC42。第三部分SLC33A1基因突变导致SPG42定位候选克隆是指在基因定位的基础上,对致病基因候选区域内已知基因的表达模式和功能进行分析,把那些在病变组织中表达、或基因功能与疾病病理生理机制有关的基因列为候选基因,然后通过突变分析进行证实。在将该家系的致病基因定位于染色体3q24-3q26区段上22cM的区域后,我们采用“定位候选克隆"的策略来分离鉴定其致病基因。在这段22CM的区域内,共有130多个己知基因。我们首先选择那些在功能上可能会导致遗传性痉挛性截瘫发病的基因进行突变检测,分别检测了PFN2、SCHIP1、SLITRK3、MYNN、CLDN11,均没有发现异常的突变。在排除了这5个候选基因后,我们在SLC33A1基因第一外显了发现了一个c.339 T→G突变,该突变导致SLC33A1蛋白第113位氨基酸由丝氨酸突变为精氨酸。测序和tetra-primer ARMS两种方法都证实了该家系中的所有患者都携带该突变,而家系里的正常人都没有携带该突变。进一步在正常人群中选择了200名个体进行了群体验证,发现群体中没有人携带该突变,提示该位点不是一个单核苷酸多态。SLC33A1基因编码acetyl-CoA的转运体蛋白,该蛋白共有549个氨基酸,并包含多个跨膜结构域,其中还存在一个亮氨酸拉链的结构域。采用SNAP软件和PolyPhen软件进行生物信息学分析,预测SLC33A1基因p.S113R氨基酸突变可能导致的表型效应分别为"non-neutral"和"probably damaging",说明该突变很可能影响了SLC33A1蛋白的正常功能。通过一个在线的蛋白跨膜结构域预测软件SOSUI预测,p.S113R位点的突变引起了蛋白跨膜结构域的改变,使SLC33A1蛋白第二个跨膜结构域移出了跨膜区域,并造成其他的膜内和膜外的区域出现镜像翻转,预测SLC33A1蛋白功能会因此完全丧失,但是并不影响SLC33A1的亚细胞定位。我们采用免疫荧光共定位的方法也验证了突变并未改变SLC33A1的亚细胞定位,突变型和野生型的SLC33A1蛋白均定位于内质网膜上。蛋白的保守性分析发现第113位的丝氨酸在各个物种中都非常保守,说明该氨基酸位点发挥着比较重要的生理功能。最新的研究提示,SLC33A1是位于内质网膜上的乙酰辅酶A的转运体,通过乙酰辅酶A的转运参与到内质网中一系列蛋白的乙酰化修饰过程。我们的研究分离得到了一个新的遗传性痉挛性截瘫(SPG42)的致病基因SLC33A1,也是首次揭示SLC33A1基因突变可以直接导致人类疾病。这不仅有助于阐明遗传性痉挛性截瘫发病的分子机制,而且有助于对家系成员进行遗传咨询和产前诊断。第四部分SPG42遗传性痉挛性截瘫家系的产前诊断遗传性痉挛性截瘫是一种晚发性的神经退行性疾病,起病时间跨度较大,且病情轻重程度变异也很大,即使在一个家系当中,患者和患者之间病情的轻重程度和起病时间等也存在较大差异,这就给遗传性痉挛性截瘫的诊断带来了困难。基因诊断技术开展以前,本病只能依靠家族史、临床表现、肌电图、肌肉活检等进行诊断,对于轻症和不典型患者的诊断非常困难。目前,基因诊断已经成为遗传性痉挛性截瘫诊断的金标准。对于遗传性痉挛性截瘫,最常见的是常染色体显性遗传性痉挛性截瘫,患病与否与性别无关。患者生育后代有50%的机率为正常人,50%的机率为患者。对于家系中未发病成员,有可能是携带者,尚未达到发病年龄或者症状十分轻微。在遗传咨询工作中,携带者的检出对于预防患儿的出生非常重要,而基因诊断能够简便、准确的判断携带者。在分离得到该大家系的致病基因后,我们为全家系成员做了基因诊断。随后,我们先后为两位家系成员施行了胎儿产前基因诊断。直接测序分析SLC33A1基因第一外显子的结果提示两个胎儿都没有携带c.339 T→G突变；连锁分析的结果也提示两个胎儿都没有携带和致病基因连锁的单体型,同时连锁分析的结果还排除了从羊水中提取的胎儿基因组DNA受到母体污染的可能性。联合应用STR连锁分析和直接测序的方法可以提高产前诊断的准确度。第五部分一X连锁Charcot-Marie-Tooth病家系致病基因的分离与鉴定Charcot-Marie-Tooth(CMT)病也被称为遗传性运动感觉周围神经病(Hereditary motor and sensory neuropathies, HMSN)和腓骨肌萎缩症,是一组遗传异质性非常高的周围神经系统的神经遗传病,其临床特点为缓慢进展的上、下肢远端肌肉尤其是双下肢远端肌肉进行性肌无力和萎缩,可呈典型的“鹤腿”样畸形,伴有肢体远端轻到中度的感觉障碍和腱反射减弱或消失,大多数患者在20岁以前发病。根据Charcot-Marie-Tooth病的病理和电生理特点,将其分为两型：Ⅰ型(脱髓鞘型)和Ⅱ型(轴索型)。Ⅰ型(脱髓鞘型)病理改变以周围神经脱髓鞘为主,Ⅱ型(轴索型)病理改变以周围神经轴索变性为主。Ⅰ型(脱髓鞘型),神经传导速度下降明显,正中神经运动传导速度<38m/s,Ⅱ型(轴索型)神经传导速度正常或者接近正常。Charcot-Marie-Tooth病按遗传方式可以分为常染色体显性遗传(AD),常染色体隐性遗传(AR)及X连锁(X-linked)遗传。其中,常染色体显性遗传的Charcot-Marie-Tooth病以CMT1A最为常见,占CMT患者的40%-50%,突变基因为PMP22。PMP22基因编码一种髓鞘蛋白,该基因的重复突变是导致CMT1A的最常见原因,此外少数为点突变。X连锁的Charcot-Marie-Tooth病(CMTX)占到了CMT患者的10%-20%,其中,90%以上的CMTX是由于GJB1基因突变所致。GJB1基因编码一种32KD的间隙连接蛋白CONNEXIN32,组成间隙连接通道介导相邻细胞间的离子、小分子营养物质交换及信号分子传播。我们在山东济宁地区发现了一个CMT大家系,共4代19人,发现其无男传男现象,临床症状男重女轻,初步考虑其为CMTX型。我们对该家系进行了临床分析和辅助检查,以及相关的基因检测及验证工作,发现该家系的突变基因为GJB1基因,并发现了一个新的突变。该家系GJB1基因突变c.110de1T(p. V37GfsX47)造成CX32蛋白从第一个跨膜结构域开始就出现移码突变,并提前出现终止密码子。突变后截短的蛋白缺少CX32蛋白几乎所有重要的功能结构域,因此,该突变造成了CX32蛋白完全丧失功能。该家系致病基因的分离鉴定,为患者下一步遗传咨询和产前诊断打下了基础。综上所述,本研究鉴定了两个与神经轴索变性和脱髓鞘有关的神经遗传病家系的致病基因：定位了一个新的遗传性痉挛性截瘫的致病基因位点SPG42;首次揭示了SLC33A1基因突变可以导致一种新的常染色体显性遗传性痉挛性截瘫的亚型(SPG42);在此基础上我们成功的为两位家系成员提供了产前诊断,预防了患儿的出生；在Charcot-Marie-Tooth病家系中发现了GJB1基因一个新的缺失突变,该缺失突变造成了所编码的蛋白从第37个氨基酸就开始出现移码突变,并提前出现终止密码子。这些研究结果为了解遗传性痉挛性截瘫和Charcot-Marie-Tooth病的发病机制,以及神经轴索变性和脱髓鞘发生的分子机制奠定了良好的基础,并且对于研究其他神经退行性疾病也具有重要的参考价值。