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目的:TRPM4(Transient receptor potential melastatin-4,瞬时受体通道蛋白M4)是一种单价阳离子瞬时受体电位通道,表达于大部分组织与细胞中,其正常表达参与维持人体各器官系统的健康与稳态,一旦表达异常可能对人体健康造成一定程度的危害。人口腔颊黏膜及牙龈的主要成分细胞为成纤维细胞,参与人口腔颊黏膜及牙龈的创伤与修复,对维持人口腔的正常形态至关重要。成人口腔黏膜的成纤维细胞增殖率一般较低,但在创伤愈合时其增殖率升高,此时的成纤维细胞中肌动蛋白含量增加,具有收缩功能,可促进创伤的修复过程,这在口腔黏膜的创伤修复中发挥着关键作用。众所周知,收缩必然有钙信号的参与,TRPM4是否参与在此过程中的钙信号调控及其调控机制尚需进一步研究。本研究将首先通过细胞实验探索TRPM4在人口腔颊黏膜成纤维细胞中是否表达,接下来通过抑制TRPM4的表达或关闭其离子通道明确TRPM4对人口腔颊黏膜成纤维细胞迁移与增殖的影响。方法:(1)细胞培养与鉴定:于西南医科大学附属医院口腔颌面外科手术室收集因颊部黏液腺囊肿或欲进行正颌手术而就诊的患者的正常颊黏膜组织(取得患者及家属知情同意),在无菌超净台上进行原代成纤维细胞分离与原代培养。利用角蛋白抗体与波形蛋白抗体进行细胞免疫荧光实验,确定所培养出的细胞系为颊黏膜成纤维细胞;(2)TRPM4表达检测:采用实时逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)和细胞免疫荧光方法检测成纤维细胞中TRPM4的表达情况;进一步用全细胞膜片钳记录颊黏膜成纤维细胞TRPM4通道的全细胞电流,验证TRPM4在颊黏膜成纤维细胞的表达;(3)FAM-siRNA转染实验:分三组实验:A组为正常对照组;B组为使用特异性的siRNA瞬时转染沉默成纤维细胞中TRPM4基因的表达,即为实验组。通过RT-PCR与膜片钳技术检测siRNA的转染效率及沉默效果;C组则利用TRPM4特异阻断剂(9-菲酚)抑制细胞中TRPM4功能作为阳性对照组。(4)细胞增殖与迁移实验:A、B、C三组细胞均行细胞迁移(划痕实验)和增殖情况(MTT法)检测。对数生长期的成纤维细胞行划痕24 h后观察三组细胞的划痕变化的差异;利用MTT法观察三组细胞24 h后的增殖情况。结果:细胞免疫荧光实验的细胞鉴定结果显示该细胞系的角蛋白抗体染色阴性,波形蛋白抗体染色为阳性,该细胞系表达波形蛋白而不表达角蛋白,该细胞系为人颊黏膜成纤维细胞;细胞免疫荧光实验与RT-PCR实验结果分别从蛋白和mRNA水平检测到人口腔颊黏膜成纤维细胞表达TRPM4;膜片钳实验记录到TRPM4经典全细胞电流在上述细胞中的存在;特异性siRNA转染后进行RT-PCR实验,结果显示siRNA转染效率较高,TRPM4显著低表达;细胞迁移实验结果显示24 h后A组(对照组)细胞间的划痕明显较B组(siRAN转染组)与C组(9-菲酚组)更窄,即抑制TRPM4后颊黏膜成纤维细胞的迁移能力明显减弱;MTT实验结果显示第1 d A组(对照组)细胞的增殖率明显高于B组(siRAN转染组)与C组(9-菲酚组),即抑制TRPM4后颊黏膜成纤维细胞的增殖能力明显减弱。结论:人颊黏膜成纤维细胞功能性表达TRPM4通道;抑制TRPM4通道的表达和功能后,可在体外抑制细胞的增殖能力与迁移能力;TRPM4通道参与成纤维细胞增殖以及迁移能力的调控。