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鸽新城疫(Newcastle disease，ND)又被称为鸽瘟，是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)变异株鸽Ⅰ型副粘病毒(Pigeon Paramyxovirus type1，PPMV-1)引起的一种急性传染病，该病是危害养鸽业的主要疾病之一，给养鸽业造成很大的经济损失。目前我国鸽群中暴发新城疫呈上升的趋势，而对鸽源NDV所引起的固有免疫相关因子的研究相对较少，因此非常有必要从固有免疫水平上研究对鸽有宿主特异性的基因Ⅵb亚型和国内主要流行基因Ⅶd亚型鸽源NDV对宿主固有免疫相关因子的表达，为进一步了解鸽源NDV的致病性提供宿主方面的信息，对防控鸽NDV感染具有重要意义。 本研究分别设计合成了鸡的诱导性一氧化氮合酶(iNOS)、IFNβ、IFNγ和鸽的IFNγ、iNOS、MDA5、IL-2等固有免疫相关因子的特异性引物，通过克隆纯化构建质粒标准品，构建鸡的iNOS、IFNβ、IFNγ和鸽的IFNγ、iNOS、MDA5、IL-2荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)标准曲线。结果显示，所建立的标准曲线扩增效率均介于92％～102％之间，线性相关系数均大于或等于0.99，经过重复性、灵敏性、特异性检测，结果表明本研究建立检测上述因子的qRT-PCR方法均符合荧光定量检测的要求，为进一步分析检测固有免疫相关因子mRNA的表达水平提供了技术支持。 另外，本研究分别应用基因Ⅵb亚型鸽源NDV毒株GXP22和基因Ⅶd亚型毒株GXP40按100个TCID50的剂量分别感染长成单层的鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸽胚成纤维细胞(PEF)，同时设阴性对照组（用等量的DMEM培养基处理相应细胞），待病毒与细胞反应1h后，吸弃病毒液，加1％小牛血清的细胞维持液，分别收集感染后0h、6h、12h、24h、36h细胞，用实时荧光定量RT-PCR方法检测细胞中固有免疫信号通路Toll样受体和RIG-Ⅰ样受体上游中直接起抗病毒效应的TLR2、TLR3、TLR4、TLR7和MDA5以及下游细胞因子IFNα，IFNβ、IFNγ、IL-2、IL-6、iNOS等11个固有免疫相关因子表达差异。结果显示，在CEF中，TLR2，3均在12h上调表达最多，随后逐渐下降，TLR4和TLR7在12h可以检测到上调表达，但在12h后却又下调，其中基因Ⅶd亚型NDV诱导TLR2，3表达比基因Ⅵb亚型NDV更加强烈，上调倍数更高;但在PEF中，TLR2，3在24h上调表达最多，随后逐渐下降，基因Ⅵb亚型NDV诱导TLR2，3表达比基因Ⅶd亚型NDV更加强烈，TLR4和TLR7表达差异不明显。MDA5的表达情况是在检测周期内，均检测到两种基因亚型NDV引起的MDA5表达上调，在CEF中，基因Ⅶd亚型NDV诱导的表达比基因Ⅵb亚型NDV诱导的表达更强，但在PEF中，基因Ⅵb亚型NDV诱导的表达比基因Ⅶd亚型NDV的表达更多;两种细胞中干扰素的表达和TLR2、TLR3的表达相类似;在CEF细胞中，不同基因亚型NDV诱导IL-6的表达存在差异，基因Ⅵb亚型NDV能在感染后12h诱导其表达高峰，随后逐渐下降，但基因Ⅶd亚型NDV能在感染后36h诱导表达高峰;在PEF细胞中，基因Ⅶd亚型NDV能在感染后24h诱导IL-6更强烈的表达;感染两种基因亚型NDV后，iNOS在CEF和PEF中的表达与IL-6的表达呈正相关，推测IL-6可能在促进iNOS表达的发挥作用。 同时，本研究用上述两种基因亚型NDV GXP22和GXP40株按点眼滴鼻1×106ELD50/每只0.2ml人工感染30日龄的非免疫鸽，感染后第3、7天随机扑杀5只，用同样的方法检测脾脏中上述11个固有免疫相关因子表达差异，并检测其病毒载量;采集发病鸽的脾脏、胰脏和盲肠扁桃体组织做HE染色;在感染后3、7、10、14d检测血清NDV抗体水平的变化。结果显示，两种基因亚型鸽源NDV感染非免疫鸽后，均可以引起鸽体内靶器官脾脏、胰脏、盲肠扁桃体等产生不同程度的病理变化。脾脏中的病毒载量在7DPI明显升高，并且GXP40组病毒载量比GXP22组高。在感染后第8d均可以引起血清抗体水平的升高，两组差异不显著。感染基因Ⅵb亚型GXP22后3d，可以检测到TLR3、TLR4、TLR7、MDA4、iNOS等均有明显的上调，分别上调表达了2.632倍、2.667倍、7.840倍、3.391倍、3.307倍，在感染后第7d的时候，TLR3、TLR7、iNOS等细胞因子表达上调，分别上调了43.520倍，7.231倍，3.190倍;感染基因Ⅶd亚型的GXP40后3d，可以检测到TLR3、TLR4、TLR7、MDA5、iNOS分别上调了6.302倍，6.380倍，16.069倍，6.853倍，11.531倍，在感染后第7d的时候可以检测到TLR7、IFNα、MDA5有明显上调表达，分别上调12.505，4.873，3.830倍，表明在NDV感染后3d和7d的脾脏中，两感染组均可检测到TLR3、TLR4、TLR7、MDA5、iNOS等因子的上调表达，所检测的固有免疫相关因子的表达也类似，但基因Ⅶd亚型NDV所引起的固有免疫相关因子的表达相较于基因Ⅵb亚型NDV更强烈。 本课题的研究结果表明，建立了7种禽固有免疫相关因子荧光定量检测方法，均可用于临床检测;证明了两种鸽源NDV均可以感染CEF和PEF并引起固有免疫相关因子的表达，但不同的基因亚型鸽源NDV体外感染细胞引起固有免疫相关因子的表达存在差异;基因Ⅵb亚型和基因Ⅶd亚型鸽源NDV均可引起非免疫鸽发病，并导致主要感染靶器官发生病理变化，同时均可引起非免疫鸽固有免疫相关因子的上调表达，但两种基因亚型鸽源NDV感染引起脾脏中固有免疫相关因子的表达变化与在体外感染PEF的结果有一定的差异，表明NDV体内感染过程中存在动物机体其他因子参与免疫调节。