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SUMO化修饰作为一种重要的蛋白翻译后修饰方式,参与了细胞内一系列生理过程的调控。迄今为止,共发现了4种SUMO蛋白,分别为SUMO-1、SUMO-2、 SUMO-3以及SUMO-4,由于SUMO-2和SUMO-3包含96%相同的氨基酸序列,也被认作为SUMO-2、3。在有丝分裂中,关于SUMO-1的研究表明其介导的SUMO化修饰具有多种生物学功能,包括调控底物蛋白的稳定性、转录活性以及在细胞中的定位,调节染色体的凝集与分离、DNA修复、核质转运以及细胞内信号转导等过程,然而在小鼠卵母细胞减数分裂中SUMO-1所介导的SUMO化修饰的功能及其发挥作用的分子机制,相关报道还比较少。本实验以昆明小鼠卵母细胞为研究对象,运用卵母细胞体外细胞培养、显微注射、体外转录、Western blot、免疫荧光以及染色体爬片等技术,旨在揭示以下问题：(1)SUMO-1是否对卵母细胞减数分裂成熟过程有影响；(2)SUMO-1在卵母细胞成熟过程中的具体作用时期；(3)SUMO-1对卵母细胞非整倍体形成的影响；(4)SUMO-1对卵母细胞纺锤体组装和染色体分离的影响；(5)SUMO-1对染色体分离与凝集的影响；(6)SUMO-1对微管与着丝粒结合的影响；(7)SUMO-1对与纺锤体组装和染色体分离相关蛋白的影响：(8)青年小鼠和老年小鼠卵母细胞中SUMO-1的表达和定位是否具有年龄差异性。基于以上研究,我们可以进一步了解小鼠卵母细胞减数分裂的调控机制,为理解哺乳动物卵母细胞减数分裂提供更多的理论基础。研究包含的内容以及结果如下：1、抑制或者干扰SUMO-1对卵母细胞减数分裂过程影响的研究：向GV期卵母细胞注射特异的SUMO-1/UBC9抗体或者sirNA来抑制或干扰SUMO-1的功能,注射之后将卵母细胞体外培养14h,并在2.5h观察GVBD率,14h检测PB1排放率。结果发现,抑制或者干扰SUMO-1后,可以显著抑制卵母细胞GVBD和PB1排放率。2、过表达SUMO-1对卵母细胞减数分裂影响的研究：向GV期卵母细胞注射体外合成的SUMO-1mRNA,注射后将卵母细胞体外培养14h,并在2.5h观察GVBD率,14h检测PB1排放率。结果发现,过表达SUMO-1对卵母细胞GVBD和PB1排放率无显著影响。3、SUMO-1在减数分裂过程中其作用的具体时期的研究：为了研究SUMO-1在卵母细胞减数分裂过程发挥作用的具体时期,我们将卵母细胞培养0h、6h以及9.5h,分别代表卵母细胞处于GV, pro-MI和AI期。向这些时期的卵母细胞注射SUMO-1抗体,然后再进行体外培养,注射前后的培养总时间到14h后检测PBl排放率。与对照组结果相比,向GV和pro-MI时期的卵母细胞注射SUMO-1抗体显著抑制PB1排放,而向AI期卵母细胞注射SUMO-1抗体则对PB1排放无明显影响,这些结果说明SUMO-1在AI期之前调控卵母细胞PB1排放。4、抑制SUMO-1对非整倍体形成影响的研究：抑制GV期卵母细胞SUMO-1之后,将卵母细胞体外培养14h,运用染色体爬片的方法检测成熟卵母细胞中染色体数目。结果发现,在抑制SUMO-1之后,成熟卵母细胞中有非整倍体出现,而对照组中没有发现非整倍体。5、抑制或者干扰SUMO-1对纺锤体组装和染色体排列的影响研究：向GV期卵母细胞注射特异的SUMO-1/UBC9抗体或者siRNA来抑制或干扰SUMO-1的功能,注射之后将卵母细胞体外培养14h,运用免疫荧光技术对成熟和非成熟卵母细胞α-tubulin进行染色,以PI对染色体染色。结果发现注射SUMO-1/UBC9抗体或siRNA后成熟和非成熟卵母细胞中纺锤体异常率明显增加,且染色体排列出现异常。6、抑制SUMO-1对γ-tubulin定位的影响：抑制GV期卵母细胞SUMO-1功能之后,将卵母细胞体外培养14h,运用免疫荧光技术对成熟和非成熟卵母细胞γ-tubulin进行染色。结果发现,在非成熟和成熟卵母细胞中γ-tubulin均定位于纺锤体两极,在抑制SUMO-1后,非成熟卵母细胞中有一部分γ-tubulin从纺锤体极上解离下来,在有些成熟卵母细胞中检测不到y-tubulin在纺锤体极上的定位。7、抑制SUMO-1对染色体形态的影响：抑制GV期卵母细胞SUMO-1功能之后,将卵母细胞体外培养8h,运用染色体爬片检测染色体形态。结果发现,在抑制SUMO-1之后,74.2%的卵母细胞中表现出染色体凝集不足,而对照组卵母细胞染色体形态完全正常。8、干扰SUMO-1对微管与着丝粒结合影响的研究：干扰GV期卵母细胞SUMO-1功能之后,将卵母细胞体外培养8h,随后将卵母细胞4℃处理10min,对α-tubulin和着丝粒进行免疫荧光染色。与对照组结果相比,在干扰SUMO-1之后,纺锤体与着丝粒之间的结合变的不稳定,并且着丝粒在卵母细胞中排列混乱。9、抑制SUMO-1对与纺锤体组装和染色体分离相关蛋白影响的研究：抑制GV期卵母细胞SUMO-1功能之后,将卵母细胞体外培养8h。运用免疫荧光以及卵母细胞染色体爬片技术,检测与纺锤体组装和染色体分离相关蛋白的表达和定位情况。结果发现,在抑制SUMO-1之后,BubR1在着丝粒上的定位显著减少,securin在纺锤体上的定位显著减少,并且几乎检测不到REC8在染色体上的定位。10. SUMO-1在年龄差异小鼠GV期卵母细胞中定位与表达的研究：取3周龄以及12月龄小鼠GV卵母细胞,通过免疫荧光以及western blot技术,检测SUMO-1在年龄差异小鼠卵母细胞中定位和表达情况。结果发现,在GV期卵母细胞中,12月龄小鼠SUMO-1的表达显著低于3周龄小鼠,并且在生发泡中的定位信号也明显减少。总之,以上结果表明SUMO-1在小鼠卵母细胞成熟过程中发挥了重要的作用,通过调控纺锤体与着丝粒之间的结合,y-tubulin、BubR1、securin以及REC8的定位,参与了染色体行为及纺锤体组装的调控,并且其在卵母细胞中的表达和定位具有一定的年龄差异性。这些结果将使我们更好的理解卵母细胞减数分裂,并且为提高家畜繁殖力提供更多的理论基础。