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第一部分Perlecan、bFGF和VEGF在喉癌细胞Hep-2及喉鳞癌中的表达实验一Perlecan、bFGF和VEGF在喉癌细胞Hep-2中的表达目的：研究串珠素（HSPG2／perlecan）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）及高亲和力受体（FGFR）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其高亲和力受体在喉癌细胞Hep-2中的表达，探讨它们与喉癌的生长、浸润及转移的关系。方法：培养喉癌细胞Hep-2和正常永生化表皮细胞（HaCaT），提取细胞总RNA，应用RT-PCR方法检测perlecan mRNA、bFGF及4个高亲和力受体（FGFR）mRNA、VEGF及2个高亲和力受体（Flt-1、KDR）mRNA在喉癌细胞Hep-2和HaCaT细胞中的表达；应用免疫细胞化学染色检测perlecan、bFGF、VEGF在Hep-2细胞和HaCaT细胞中的表达。结果：perlecan mRNA、bFGF mRNA及VEGF mRNA在Hep-2细胞中高表达，它们的平均相对吸光度值分别为：0.8310±0.0504、0.79187±0.05842及0.83890±0.06311；它们在HaCaT细胞中低表达，平均相对吸光度值分别为：0.2743±0.0629、0.29595±0.04911及0.30512±0.06614。在Hep-2细胞中有FGFR-1 mRNA、FGFR-2 mRNA及FGFR-4 mRNA表达，它们的相对平均吸光度值分别为：0.7475±0.0742、0.6780±0.0776、0.7170±0.0577，未检测到FGFR-3 mRNA表达。在Hep-2细胞中有FIt-1mRNA高表达，平均吸光度值为：0.73886±0.13779，未检测到KDR mRNA表达。免疫细胞化学染色表明，perlecan、bFGF和VEGF在Hep-2细胞中高表达，它们的平均相对吸光度值分别为：0.2557±0.0287、0.2380±0.04434及0.2266±0.03829；它们在HaCaT细胞中低表达，平均相对吸光度值分别为：0.0730±0.0111、0.0780±0.01426及0.0743±0.01774。结论：Perlecan、bFGF和VEGF在喉癌细胞Hep-2的发生发展中起重要的作用。实验二Perlecan、bFGF和VEGF在喉鳞癌中的表达目的：研究串珠素（HSPG2／perlecan）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）及高亲和力受体（FGFR）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其高亲和力受体在喉鳞癌中的表达，探讨它们与喉鳞癌的生长、浸润及转移的关系。方法：应用RT-PCR方法检测62例喉鳞癌、54例癌旁组织和9例正常喉黏膜组织中的perlecan mRNA、bFGF及4个高亲和力受体（FGFR）mRNA、VEGF及2个高亲和力受体（Flt-1、KDR）mRNA的表达。结果：perlecan mRNA在喉鳞癌组织中高表达，在正常喉黏膜中低表达，差异有显著性意义（P＜0.01），并且在喉鳞癌组织Ⅰ期+Ⅱ期与Ⅲ期+Ⅳ期表达之间差异有显著性意义（t=-9.223，P＜0.01）。bFGF mRNA在喉鳞癌组织中高表达，在正常喉黏膜中低表达，差异有显著性意义（P＜0.01），并且在喉鳞癌组织Ⅰ期+Ⅱ期与Ⅲ期+Ⅳ期表达之间差异有显著性意义（t=-8.965，P＜0.01）。在喉鳞癌组织中bFGF有FGFR-1 mRNA、FGFR-2 mRNA和FGFR-4 mRNA等3个高亲合力受体高表达，未检测到FGFR-3 mRNA表达。VEGF mRNA在喉鳞癌组织中高表达，在正常喉黏膜中低表达，差异有显著性（P＜0.01），并且在喉鳞癌组织Ⅰ期+Ⅱ期与Ⅲ期+Ⅳ期表达之间差异有显著性（t=-6.279，P＜0.01）。检测VEGF受体Flt-1 mRNA和KDR mRNA表明，在喉癌组织中有Flt-1 mRNA表达，相对平均吸光度值为：0.8074±0.08776，未检测到KDR mRNA表达。免疫组织化学染色表明，perlecan在喉癌组织中高表达，在正常喉黏膜中低表达，差异有显著性的意义（t=47.892，P＜0.01）；bFGF在喉鳞癌中高表达，定位于癌细胞的细胞质，在正常喉黏膜弱表达或不表达，二者差异有显著性的意义（t=41.043，P＜0.01）；VEGF在喉癌组织中高表达，在正常喉黏膜中低表达，差异有显著性的意义（t=22.569，P＜0.01）。结论：Perlecan、bFGF和VEGF与喉鳞癌的发生发展有密切关系。第二部分串珠素反义cDNA对喉癌细胞Hep-2增殖能力的影响目的：研究串珠素（HSPG2／perlecan）反义cDNA质粒转染对喉癌细胞Hep-2增殖及细胞侵袭能力的影响。方法：利用阳离子脂质体作为载体，把重组真核表达载体perlecan反义cDNA质粒pAP转染喉癌细胞Hep-2，通过RT-PCR、Western blot、MTT法及Transwell法检测转染后Hep-2细胞perlecan mRNA、蛋白质表达、细胞增殖水平及细胞侵袭能力，并观察转染后Hep-2细胞对碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子的反应性。结果：将perlecan反义cDNA质粒pAP成功地转入Hep-2细胞，获得了稳定表达的perlecan反义cDNA基因的细胞系。perlecan mRNA和蛋白质水平在pAP转染组细胞低表达，在空质粒转染组和野生组细胞高表达，差异有显著性意义（P＜0.01）。在0.1％FCS的RPMI 1640培养基培养下，野生型、空质粒转染细胞和反义转染细胞的增殖率均降低，但反义转染细胞的增殖与野生型和空质粒转染细胞相比明显减低；在0.1％FCS+1ng／ml bFGF和0.1％FCS+20 ng／ml VEGF的RPMI 1640培养基培养下，野生型和空质粒转染细胞的增殖接近正常，但反义转染组细胞的增殖能力较弱。Transwell法测定Hep-2细胞侵袭能力表明，野生组和空质粒转染组Hep-2细胞侵袭能力较强，反义转染组Hep-2细胞侵袭能力较弱。它们之间差异均有显著性意义（P＜0.01）。结论：串珠素反义cDNA质粒转染可以有效地抑制喉癌细胞Hep-2的增殖及侵袭能力。第三部分串珠素反义cDNA对人喉癌裸鼠移植瘤的抑制作用目的：研究串珠素（HSPG2／perlecan）反义cDNA质粒对喉癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤的影响。方法：应用perlecan反义cDNA质粒转染的喉癌Hep-2细胞，建立人喉癌裸鼠移植瘤模型，观察裸鼠移植瘤的生长速度。通过RT-PCR和免疫组织化学方法检测裸鼠移植瘤的perlecan mRNA和蛋白质表达情况。结果：肿瘤生长4W后，野生组和空质粒转染组裸鼠移植瘤的平均体积较大，反义转染组裸鼠移植瘤的平均体积较小，差异均有显著性意义（P＜0.01）。perlecan mRNA在野生组（WT组）和空载体转染组（neo组）高表达，在反义转染组（pAP组）低表达。perlecan mRNA在WT组和neo组与pAP组表达之间差异均有显著性意义（t=19.278和t=16.562，P＜0.01）。perlecan蛋白水平在WT组和neo组高表达，定位于癌细胞的细胞核和胞浆，在pAP组低表达。Perlecan蛋白在WT组和neo组与pAP组表达之间差异均有显著性意义（t=16.567和t=12.723，P＜0.01）。结论：串珠素反义cDNA质粒对喉癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤的发生发展有重要影响。