【摘 要】
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背景中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）细胞是生产重组蛋白药物的首选宿主。传统稳定CHO细胞工程株主要是通过目的基因随机整合到宿主细胞基因组中,这种方法无法控制目的基因的整合位点,容易出现“位置效应”导致的转基因沉默及基因表达衰减的现象。胞苷酸N-乙酰神经氨酸羟化酶（CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase,CMAH）在人体中已经
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背景中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）细胞是生产重组蛋白药物的首选宿主。传统稳定CHO细胞工程株主要是通过目的基因随机整合到宿主细胞基因组中,这种方法无法控制目的基因的整合位点,容易出现“位置效应”导致的转基因沉默及基因表达衰减的现象。胞苷酸N-乙酰神经氨酸羟化酶（CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase,CMAH）在人体中已经缺失,利用CHO细胞生产重组药物蛋白时,CMAH产生的N-羟乙酰神经氨酸（N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc）可能会引起人体的免疫反应。成簇规律间隔的短回文序列（Clusterd regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9,CRISPR/Cas9）技术是新兴基因编辑技术的一种,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术能够实现目的基因定点整合及表达。目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对CHO细胞进行改造,获得理想的CMAH位点定点整合的重组CHO细胞株。方法1.生物信息学分析:通过NCBI查找CHO细胞的胞苷酸N-乙酰神经氨酸羟化酶（CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase,CMAH）的基因序列,选择CMAH基因序列的编码区8作为目的序列,利用在线软件ZIFIT设计出CMAH的sg RNA。2.载体构建:（1）根据靶位点CMAH基因序列设计sg RNA,构建CRISPR/Cas9-sg RNA系统。（2）将目的基因EGFP基因、EPO基因、EPO-FC基因构建到实验室MAR表达载体表达框,根据CMAH基因序列设计同源臂序列并克隆到目的基因两侧,构建供体载体。3.细胞转染及筛选:培养CHO细胞,利用脂质体转染法将供体载体和CRISPR/Cas9-sg RNA系统共转染CHO细胞,而只转染供体载体的CHO细胞作为对照;使用杀稻瘟菌素（Blasticidin S hydrochloride）和嘌呤霉素（Puromycin Dihydrochloride）进行筛选,获得稳定细胞株。利用有限稀释法在96孔板以1个细胞/孔进行接种,获得单克隆细胞。4.细胞定点整合验证:根据CMAH基因序列设计PCR引物,提取CHO细胞基因组DNA作为PCR反应模板,PCR反应产物进行测序,确认目的基因是否发生定点整合。5.单克隆细胞m RNA表达检测:设计q PCR引物,提取定点整合细胞株总RNA并反转录为c DNA,检测CMAH基因和目的基因的m RNA表达情况。6.重组蛋白的表达:利用流式细胞技术分析定点整合细胞株和随机整合细胞株EGFP的表达情况;利用超高效液相对蛋白质量（糖型）进行检测。结果1.成功构建CRISPR/Cas9系统和供体载体。2.获得稳定细胞池,通过有限稀释法获得重组单克隆细胞。3.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在CMAH位点进行外源基因（EGFP基因、EPO基因、EPO-FC基因）的定点插入,整合效率为12.5%19.2%。4.通过EGFP的表达,发现在CMAH位点定点整合的细胞株表达量不高于随机整合的细胞株,但定点整合的细胞株蛋白表达更加稳定,不同克隆间蛋白表达异质性更低。5.通过糖型检测,相对于随机整合细胞株,定点整合细胞株表达的EPO在G0F-GN、G0、Man-5、G2FS1、G2FS2、FA4G4Lac4S4糖苷的比例增加,在表达G0F、FA3G3S3、F（6）M5A1G（4）1Ga（3）1糖苷的比例降低。结论1.在CMAH位点定点整合的细胞株与野生型细胞相比,细胞生长密度和活性无明显差异。2.与随机整合的细胞相比,在CMAH位点整合目的基因不会提高蛋白表达量,但会使蛋白表达更稳定,克隆间蛋白表达异质性更低;与随机整合细胞表达的EPO相比,在CMAH位点整合目的基因表达的EPO糖型发生变化。
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