【摘 要】
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背景Pax基因（Paired box gene）是一类重要的转录因子家族,脊椎动物生长发育过程与Pax基因功能调控紧密相关,正常表达Pax基因动态调控发育相关基因转录、促进细胞增殖与自我更新、抑制细胞凋亡、引导前体细胞定向迁移与分化。Pax3和Pax7是Pax蛋白家族成员中仅有的两个包含完整PD（Paried DNA-binding domain）、HD（DNA-binding homeodoma
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背景Pax基因（Paired box gene）是一类重要的转录因子家族,脊椎动物生长发育过程与Pax基因功能调控紧密相关,正常表达Pax基因动态调控发育相关基因转录、促进细胞增殖与自我更新、抑制细胞凋亡、引导前体细胞定向迁移与分化。Pax3和Pax7是Pax蛋白家族成员中仅有的两个包含完整PD（Paried DNA-binding domain）、HD（DNA-binding homeodomain）和OP（Octapeptide）结构域的成员,与神经发育密切相关。以前有关Pax3和Pax7的研究工作主要集中在肌肉发生发育,对其在中枢神经系统的功能探讨并不深入,特别是对神经网络构筑的影响基本空白。目的1.建立小鼠胚胎大脑皮层Pax3和Pax7异常表达模型。2.建立鸡胚视顶盖Pax3和Pax7异常表达模型。3.研究Pax3和Pax7异常表达对神经细胞迁移及轴突生长的影响。方法1.构建鼠源Pax3和Pax7过表达载体。提取C57 BL/6N小鼠胚胎脑组织RNA,进行反转录。以c DNA为模板通过PCR扩增Pax3和Pax7基因,使用酶切和连接等技术将Pax3和Pax7基因插入p CAGGS-MCS-EGFP载体的多克隆位点上,得到p CAGGSEGFP-Pax3和p CAGGS-EGFP-Pax7载体。菌落PCR和酶切鉴定插入基因,最后进行基因测序。2.鼠源Pax3和Pax7过表达载体（p CAGGS-EGFP-Pax3和p CAGGS-EGFP-Pax7）验证。通过脂质体转染和小鼠子宫内电转技术将p CAGGS-EGFP-Pax3和p CAGGSEGFP-Pax7载体分别转入N2a细胞和E13.5小鼠胚胎大脑皮层。分别使用Western Blot和免疫荧光检测鼠源Pax3和Pax7过表达载体在细胞与活体中的表达效果。3.通过鸡胚活体原位电转基因技术将鸡源Pax3和Pax7异常表达质粒转入鸡胚E4视顶盖神经上皮层,E12d取材。使用冰冻切片,免疫荧光技术检测Pax7、DCX和Map2等蛋白的表达,观察神经细胞的形态结构和各层分布情况。4.通过鸡胚活体电转基因技术将鸡源Pax3过表达载体（p MIW III-Pax3 HA）转入鸡胚E4视顶盖神经上皮层,E12d取材。提取活体电转基因表达阳性部位组织总蛋白,进行Western Blot检测Pax3过表达后Pax7、Pax6和DCX的表达情况。结果1.菌落PCR,酶切验证以及基因测序结果表明成功构建了p CAG-EGFP-Pax3和p CAGGS-EGFP-Pax7载体。2.p CAGGS-EGFP-Pax3和p CAGGS-EGFP-Pax7转染的N2a细胞的Western blot及小鼠脑组织切片免疫荧光结果表明,Pax3和Pax7基因在N2a细胞和小鼠胚胎大脑皮层中表达量增加。3.在E4鸡胚视顶盖中,Pax3过表达与Pax7基因干扰后,神经细胞无法伸出突触或伸出较短的突触。免疫荧光结果表明,实验组中DCX表达强度降低,且在转染阳性区域,DCX阳性神经细胞表达发生紊乱,呈不规则的分布。4.对鸡胚视顶盖Pax3过表达阳性部位提取蛋白,通过Western blot鉴定Pax3过表达对Pax7,Pax6,DCX表达的影响。结果显示Pax3过表达干扰了Pax7的表达,同时对DCX阳性细胞有一定程度的干扰。结论1.Pax3过表达抑制Pax7的内源性表达;2.Pax3过表达与Pax7抑制表达都能够干扰神经细胞轴突的形成;3.Pax3的过表达和Pax7抑制表达减少了多极神经细胞的突触数量和突触长度。
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