苹果砧木对镉的吸收和忍耐及相关基因MhNRAMP1克隆和功能鉴定

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:changlang0p
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果树是多年生植物,即使在重金属含量较低的土壤中,其根系也会吸收和积累较多重金属;镉是环境中毒性最强,也是目前对我国耕地污染最严重的重金属之一。苹果是全球四大水果之一,其根系来自砧木。本研究以六种苹果砧木(小金海棠、新疆野苹果、崂山柰子、八棱海棠、山定子和平邑甜茶)为试材,分析比较它们对镉的吸收、转运及耐受性,并从平邑甜茶分离克隆MhNRAMP1基因,探讨转MhNRAMP1酵母和苹果愈伤组织对镉的吸收和忍耐情况,结果表明:1.六种苹果砧木Cd含量存在显著差异,根系Cd含量远远高于地上部分。山定子地上部和根部Cd含量都最低,Cd2+吸收速率、转运系数(Tf)最小,山定子中与镉吸收相关基因MdZIPT1、MdIRT1和MdNRAMP1的表达量也低于其他砧木;新疆野苹果中MdZIPT1、MdIRT1和MdNRAMP1的表达量最高,Cd2+吸收速率和积累量也最高。除了新疆野苹果,其他5种砧木与对照相比向地上部转运Cd2+相关基因MdHMA3的表达量都表现为下调。由此发现Cd胁迫下苹果砧木幼苗对Cd2+吸收、积累情况与基因的表达相一致。以上结果表明,50μM CdSO4处理下山定子对Cd的吸收和转运能力小于其他5种苹果砧木。2.50μM CdSO4处理14 d后,新疆野苹果的根长、鲜重和根系活力下降幅度、细胞死亡率增加幅度、MDA含量和叶片H2O2含量的增加幅度均最高,山定子干重下降幅度和叶片H2O2含量增加幅度最低,八棱海棠根系细胞死亡率增加幅度最低;八棱海棠根系POD和SOD活性提高幅度最大,崂山柰子叶绿素相对含量降低幅度最大,八棱海棠和山定子变化不显著。在主成分分析的基础上,利用隶属函数对各砧木所测指标进行综合分析显示,六种苹果砧木由强到弱的耐镉能力顺序为:八棱海棠>山定子>平邑甜茶>崂山柰子>小金海棠>新疆野苹果。3.MhNRAMP1基因,它的开放阅读框(ORF)长度为1638 bp,编码含有545个氨基酸的蛋白,预测其蛋白质分子量为59.12kD,定位于质膜,并具有12个跨膜结构;利用瞬时转化烟草叶片技术,基因MhNRAMP1被鉴定出特异定位于质膜处,是一种膜蛋白;在根、茎、叶中都能表达且具有特异性,其中根部表达最高,其次是叶,茎部最低。在根部的表达量随镉胁迫明显上调,在茎中略有上调,而在叶片部位其表达量下降较大。4.在镉处理下表达MhNRAMP1基因的酵母在点板试验和生长曲线测试中表现为长势较差,受到更为严重的毒害作用,验证了MhNRAMP1基因的表达会使酵母的镉敏感性增加。进一步测定酵母的镉含量,结果也显示与空载酵母相比,MhNRAMP1基因能够显著提高酵母中镉的积累量。综上充分说明MhNRAMP1基因在酵母中参与了镉的吸收,促进了镉的积累,提高了酵母的镉敏感性。5.在镉处理情况下,超表达基因MhNRAMP1的苹果愈伤,鲜重下降,电导率上升;利用镉荧光染色技术和MS–ICP检测苹果愈伤中的镉含量,结果均显示超表达苹果愈伤镉含量更高;利用非损伤微测技术分别检测了野生型和转基因型苹果愈伤的镉吸收速率,超表达苹果愈伤对镉的吸收速率均强于野生型。超表达基因MhNRAMP1提高了苹果愈伤的镉敏感性和镉含量,降低了其耐镉性。
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