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草酸氧化酶(ECl.2.3.4,Oxalate oxidase,OxO)催化草酸(OX)氧化生成C02和H202。生物信息学分析水稻中编码OxO的基因有4个,在3号染色体上以串联的形式排列,其编码框的相似性>90%,但启动子序列则截然不同。其中OsOx01在愈伤组织和花中表达,OsOx02在根、种子、花、茎和叶中皆不表达,OsOx03在茎和根中表达,OsOx04在叶、根、茎和种子中皆可表达,而且还可被干旱、盐害、金属离子(CuS04)和稻瘟病及百叶枯病等胁迫所诱导。本研究采用RNA干涉和过量表达技术来调控水稻中的OsOx04的表达,旨在探讨OsOx04在水稻种子成熟和萌发及胁迫中的作用。获得的主要结果如下:
1.过量表达OsOx04和特异干涉OsOx04表达的转基因植株的获得
以水稻芽cDNA为模板,利用RT-PCR扩增到含有OsOx04完整ORF和特异干涉OsOx04表达的片段,构建了组成型过量表达OsOx04约载体pOX-OsOx04和特异干涉OsOx04表达的组成型载体pYLRNAi-OsOx04。通过农杆菌介导法将其转入水稻愈伤组织,成功获得了OsOx04表达上调和下调的转基因植株。
2.转基因植株的筛选与鉴定
大部分过量表达植株中OxO活性显著提高,其中活性最高达937nmolH202/gFW.min:大部分干涉植株中的OxO活性降低。过量表达植株内源OsOx04的表达水平明显下降,但外源导入的OsOx04表达量很高:过量表达OsOx04植株叶中OsOx03表达也上调,OsOx01和OsOx02表达则未受到影响;OxO活性下调的干涉植株T2代幼苗(浸种144 h后)中OsOx04的表达有不同程度的下降,而OsOx02和OsOx03的表达水平在各株系间无明显差异,OsOx01的表达则未检测到,因此,水稻中可能存在一种由OsOx03和OsOx04编码的肽链共同组成的OxO。
3.OsOx04的功能分析
过量表达OsOx04植株叶片中的OxO活性大幅度提高,但H202和草酸含量与野生型差异不显著;CAT活性低于野生型,且差异显著;POD活性略高于野生型,但差异不显著;OxO活性最高的0-29株系中的SOD活性比其它株系都高,且差异达到显著水平。这可能是因为正常条件下水稻叶片中缺乏OxO最适的pH值和有效的底物使用。特异干涉OsOx04表达的转基因植株结实率下降,穗长变短,但是酶活下调后种子的发芽率和发芽势未受到影响,说明OsOx04在种子萌发过程中的作用不大。特异干涉OsOx04表达的转基因植株对冷害更敏感,过量表达OsOx04的转基因植株对Cd2+、A13+和冷害的抗性增加,对盐和干旱胁迫的作用则不明显。因此,OsOx04很可能在水稻抵抗重金属离子和冷胁迫中具有积极的作用。