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甜菜M14品系是在栽培甜菜(Beta vulgaris L.)染色体组上附加有野生白花甜菜(Beta corolliflora Zoss.)第9号染色体的甜菜单体附加系。经鉴定甜菜M14品系具有野生白花甜菜的一些优良性状,如抗旱性、抗寒性、耐盐性以及无融合生殖等,推测可能是导入的白花甜菜第9号染色体使甜菜M14品系获得了野生品种的一些优良性状,因此甜菜M14品系是挖掘和利用甜菜优质基因的良好材料。单脱氢抗坏血酸还原酶在植物中具有再生还原态的抗坏血酸和参与电子传递的生理功能,是抗坏血酸再生的关键酶,可以将单脱氢抗坏血酸还原成抗坏血酸,这在清除活性氧、维持植物细胞还原性和抵抗盐胁迫等方面具有重要意义。课题组前期运用iTRAQ串联HPLC-MS/MS技术鉴定0、200、400mM NaCl胁迫下的甜菜M14品系叶片与根总蛋白,发现了上调表达的单脱氢抗坏血酸还原酶蛋白MDHAR。进一步利用盐胁迫甜菜RNAseq数据库中的BvM14-MDHAR基因的Unigene序列设计引物,克隆获得甜菜M14品系BvM14-MDHAR基因。本试验从生物信息学、组织特异性表达以及构建原核和植物表达体系等方面对基因进行了耐盐性应答反应的研究。BvM14-MDHAR基因cDNA全长1737bp,包含最大开放阅读框ORF 1059bp,编码352个氨基酸。氨基酸多重序列比对分析发现甜菜BvM14-MDHAR蛋白与菠菜MDHAR蛋白相似性最高,可达到92%;亲水性预测分析发现亲水性氨基酸分布较多;信号肽预测分析发现蛋白中不存在信号肽。采用实时荧光定量(Real-Time PCR)技术对甜菜M14品系BvM14-MDHAR基因进行组织特异性表达分析。结果表明BvM14-MDHAR基因在甜菜M14品系根、茎、叶、花中的表达量大小依次为:根>叶>茎>花,其中根中的表达量比花中高出5.13 倍。本试验构建了原核表达载体pET28a-BvM14-MDHAR-His,并将构建好的重组载体转化至原核表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)中,经Western印迹鉴定,结果表明BvM14-MDHAR蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。本试验对转基因拟南芥在盐胁迫下的应答进行了研究。构建了植物表达载体pCAMBIA1305.1-BvM14-MDHAR,并转化农杆菌EHA105。利用花序侵染法分别获得了拟南芥MDHAR基因过表达植株(OX)和拟南芥MDHAR基因突变恢复植株(CO)的阳性转基因植株,对拟南芥野生型植株(WT)、拟南芥MDHAR基因突变植株(KO)、拟南芥MDHAR基因过表达植株(OX)和拟南芥MDHAR基因突变恢复植株(CO)四种植株的多项生理指标进行比较:(1)在表型方面对拟南芥的鲜重、根长进行测定及比较;(2)在生理指标方面对拟南芥的叶片叶绿素含量、电导率、抗坏血酸还原状态、K+、Na+含量进行测定及比较;(3)在转录水平对脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因在拟南芥叶片中转录水平的表达量进行测定;(4)在蛋白活性方面对单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)活力、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活力进行比较。结果表明,相对于拟南芥野生型植株(WT)和拟南芥MDHAR基因突变植株(KO),转入BvM14-MDHAR基因的MDHAR基因过表达植株(OX)和MDHAR基因突变恢复植株(CO)对盐胁迫具有更强的耐受性,表明甜菜M14品系BvM14-MDHAR基因具有提高植物抵御盐胁迫的能力。