苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)在其营养生长期分泌的一种杀虫蛋白,称为营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Proteins,Vips),这种新型高毒力蛋白基因对于构建高效广谱的基因工程微生物和培育转基因抗虫植物、控制害虫抗性发展都具有重要意义,被认为是第二代抗虫基因,其中Vip3A蛋白基因研究的最为清楚。本研究利用PCR技术克隆了Vip3A基因,序列分析表明:该基因全长2370 bp,编码789个氨基酸,其序列及预测蛋白质与已知的Vip3A氨基酸的同源性均在99%以上,该基因蛋白分子量为88 KDa,为弱酸性蛋白质。对Vip3A基因核苷酸序列及其编码的氨基酸残基序列进行生物信息学预测发现:Vip3A基因编码的蛋白质前端具有信号肽,并且是跨膜信号,它是一种胞外分泌蛋白,Vip3A蛋白的C端有一个稳定的功能区,二级结构预测显示这个蛋白有较明显的β折叠、α螺旋和无规则卷曲。这些特殊区域可能与其功能密切相关。为了研究Vip3A基因在转基因抗虫植物中的应用,及考虑到外源抗虫基因在转基因植物中表达水平低的原因,本实验又利用PCR技术克隆了烟草的EF1α启动子,该启动子是一种很好的花组织高效表达启动子,经测序及序列分析:该启动子全长1115 bp,含有EF1α基因的起始的63个编码碱基序列,含有TATA-box、CAAT-box等多个保守区,高效转录作用元件5UTR Py-rich stretch;抗氧化作用元件ARE;光反应元件Box I、Sp1;乙烯反应元件ERE;热激作用元件HSE;MYB蛋白结合位点MBS等多个顺式作用元件。将克隆的Vip3A基因和EF1α启动子,以pBI121质粒为基本载体,分别成功构建了EF1α启动子驱动GUS基因的植物表达载体pBIEF,及由组成型CaMV35S启动子和花特异表达的EF1α启动子驱动Vip3A基因的植物表达载体pBIVip3A和pBIEFVip3A。且将这些构建好的植物表达载体通过农杆菌介导的方法对烟草进行了遗传转化,经PCR检测,外源基因已整合到烟草基因组中,经PCR检测,外源基因已整合到烟草基因组中,并对获得的阳性转基因植株通过GUS组织化学染色及RT-PCR进行了表达分析。