论文部分内容阅读
目的恶性胶质瘤是目前最为盛行的原发脑瘤,干细胞移植极有希望治疗胶质瘤。因骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)体内体外均显示很强的胶质瘤趋化性,所以应用BMSCs治疗胶质瘤即是很好的细胞治疗手段。然而,关于细胞因子参与BMSCs迁移的报道却很少,本研究旨在探讨成神经分化的BMSCs向C6细胞条件培养基和SDF-1α(stromal cell-derived factor 1α)的迁移行为。方法本实验分三个阶段研究成神经分化的BMSCs向C6细胞条件培养基和SDF-1α的迁移。(1)采用Percoll分离法在体外培养并扩增BMSCs,通过免疫荧光染色的方法检测表面抗原对BMSCs进行鉴定。(2)采用抗氧化剂诱导方案诱导BMSCs向神经样细胞分化,即先用浓度为10 ng/ml的bFGF预诱导24 h,加入浓度为200μM的丁羟基茴香醚(BHA)和2%的二甲基亚砜(DMSO)诱导5 h,再用含有N2的H-DMEM维持48 h。观察诱导分化过程中BMSCs的形态变化,通过免疫荧光染色检测诱导的细胞表达神经细胞特异性标志物Nestin、β-III-tubulin和NSE的情况。(3)运用Dunn chamber研究了分化细胞在具有浓度梯度的趋化因子中的定向迁移行为。分化不同状态BMSCs的迁移通过德国Leica AF6000活细胞工作站拍摄得到图像,应用NIH Image J分析图像,每个分化点随机抽取40个细胞进行统计得到细胞的迁移速率、迁移效率和诱导5 h的迁移轨迹。接着,我们运用Boyden chamber研究了BMSCs在成神经分化过程中的趋化性迁移(Chemotaxis)和随机迁移(Chemokinesis)。以正常培养的BMSCs作为对照,随机抽取对照组和实验组各10个视野,细胞计数,计算迁移系数,迁移系数=实验组/对照组。结果(1)采用Percoll淋巴细胞分离液及不连续密度梯度法,成功分离培养出大鼠骨髓间充质干细胞,可稳定传至20代以上。表型鉴定结果为CD29、CD71、CD90、CD106呈阳性,CD34、CD45呈阴性。(2)用bFGF/BHA诱导BMSCs向神经样细胞分化,预诱导24 h,细胞变成长梭形;诱导5 h,细胞即发生剧烈的形态改变,出现胞体回缩、突触伸展等神经细胞的形态特征;维持48 h,细胞出现更多的分叉,并出现二级叉。对照组细胞无明显的形态变化,免疫荧光染色显示诱导的细胞表达神经前体细胞标志物Nestin、β-III-tubulin和成熟神经元标志物NSE。对照组不表达NSE,诱导组与对照组比较有统计学差异(P<0.05)。(3) Dunnchamber分析显示,C6细胞条件培养基组和SDF-1α组诱导细胞的迁移速率和迁移效率明显高于对照组,表明C6细胞条件培养基和SDF-1α对BMSCs具有趋化作用,单个细胞迁移轨迹实验也证实了这一结果。此外,分化不同状态的BMSCs向C6细胞条件培养基和SDF-1α的趋化程度也不同。当Boyden上室为L-DMEM悬浮的细胞,下室为C6细胞条件培养基时,分化细胞的迁移数目明显多于对照;而当上下室均为C6细胞条件培养基时,分化细胞的随机迁移与对照无显著差异。结论BMSCs的定向迁移与分化状态密切相关,预诱导24 h分化细胞的定向迁移最强。