日本血吸虫病仍然是我国重点防治的传染性疾病之一。目前，我国的血吸虫病防治主要依靠以化疗为主的综合性防治对策，诊断技术是开展人群化疗及评价防治效果的关键防治技术之一。血吸虫病的实验室诊断主要是通过镜检和血清学检测。虽然镜检的特异性是100﹪，但敏感性较低，特别对低度流行区或轻度感染者检测时漏检率较高。免疫学检测方法具有敏感性较高、使用方便的特点，已被广泛应用于血吸虫病辅助诊断，但大多数常用抗原为天然虫体抗原或组分，存在一定的交叉反应，且不易标准化，检测试剂的批间质量不稳定。 随着现代生物技术的发展，特别是基因重组技术的应用，寻找血吸虫诊断特异性抗原编码基因，并大量生产具有诊断价值的基因重组抗原已成为可能，既可以解决抗原的大规模生产问题，又有利于抗原制备工艺的标准化，降低诊断试剂的成本，提高诊断的一致性。为此，我们利用已构建的日本血吸虫虫卵cDNA文库，以感染者血清为探针，免疫学筛选其阳性克隆；运用PCR技术和生物信息学技术，鉴定出具有潜在开发价值的日本血吸虫病诊断抗原基因，为研制以重组抗原为基础的新型诊断试剂盒奠定基础。 研究目的 获取新的具有诊断价值的日本血吸虫虫卵抗原cDNA，为研发新型重组抗原诊断试剂盒提供基础。 研究内容和方法 1．日本血吸虫虫卵cDNA文库的免疫学筛选及鉴定利用日本血吸虫病人血清筛选日本血吸虫虫卵cDNA文库，获得阳性噬菌斑，并经两次复筛，选出强阳性噬菌斑作为候选噬菌斑。 2．阳性噬菌斑插入cDNA片段的序列分析及阳性噬菌斑的复筛 2．1 采用多聚酶链反应(PCR)技术扩增出候选噬菌斑的插入片段，并运用直接测序技术测定插入cDNA片段的核苷酸序列，通过序列比对和同源性搜寻，挑选与其它寄生虫无同源性或同源性比较小的cDNA序列，作为日本血吸虫特异性的cDNA序列。 2．2 利用7份血吸虫病人血清、1份正常人血清和1份肝吸虫病人血清，对含有特异性cDNA序列的阳性噬菌斑再次进行免疫学复筛，挑出阳性反应最强的噬菌斑深入研究。 3．SjMP13基因的表达及其抗原性鉴定 3．1 SjMP13的识别：挑选出能被血吸虫病人血清强烈识别的一个阳性噬菌斑，该噬菌斑的编号为14。采用生物信息学方法分析该噬菌斑插入片段的cDNA序列，并据此设计PCR扩增的一对引物。 3．2 目的片段的克隆与表达：扩增出14号噬菌体cDNA的插入片段。按照T．-体PCR产物克隆试剂盒说明书，目的片段与T-载体在4℃连接过夜，并转化大肠杆菌BL21，涂板并利用抗性和蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，扩大培养，提取质粒，做PCR、双酶切和DNA测序鉴定。确定与T-载体连接成功后，以含14号cDNA序列的重组T-载体为模板，以基因sjMP13部分序列为引物(TaKaRa公司合成)进行PCR反应，将PCR产物与质粒、pET28a同时进行Xho I和BamH I双酶切，回收目的片段和质粒pET28a酶切后的大片段，在4℃条件下连接过夜。连接产物转化大肠杆菌BL21，利用抗性和蓝白斑筛选，将阳性克隆进行PCR、双酶切和DNA测序鉴定。重组质粒pET28a-SjiMP13经IPTG诱导表达重组蛋白，利用镍离子对pET28a上6个组氨酸的螯合作用来纯化目的蛋白，纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定。 3．3 间接ELISA法检测其抗原性：以重组SjMP13和可溶性虫卵抗原(SEA)作为抗原，采用间接ELISA检测血吸虫病人血清、肝吸虫病人血清和乙肝病人血清，评价其敏感性和特异性。 研究结果 1．日本血吸虫虫卵cDNA文库的免疫学筛选及鉴定结果以直径为9cm平板含约近4×10<2>个噬菌斑的密度进行初筛，共筛选了约四千个重组噬菌斑，获300多个初筛阳性噬菌斑。初筛阳性噬菌斑再复筛2～3次，最后挑取持续强阳性噬菌斑53个。53个强阳性噬菌斑均扩增出特异条带，但只有40个扩增片段大于500bp。这40个PCR产物送英俊技术有限公司测序，经Clusterw分析，去除重复序列后，最后得到26条待分析的cDNA序列。 2．阳性克隆插入cDNA片段的序列分析及阳性克隆的复筛结果 2．1 采用BLASTN和BLASTX与NCBI上GenBank中的已知DNA序列和蛋白质序列进行同源性检索。结果发现，在待分析的26条cDNA序列中，与已知日本血吸虫序列同源的序列(含EST)有18条，与其它物种已知序列同源的序列有4条，未发现同源序列的有8条。把这些序列进行电子延伸，其中13条序列获得延伸(>50bp)。对延伸后的序列进行相似性检索，发现与已知血吸虫序列同源的序列增加到19条，增加了序列19；与其它物种已知序列同源的序列还是4条；未发现同源序列减少到7条。 2．2对15条含有血吸虫特异性cDNA序列的阳性噬菌斑进行复筛，挑选出其中一个阳性反应最强的噬菌斑进行深入研究。经序列比对发现，挑选出的14号噬菌斑插入的cDNA片段与已知序列(AY222893.1)相同，且相似性为100﹪，其中包含一个完整血吸虫毛蚴相关蛋白基因，编码蛋白的分子量为13kDa，为此将基因命名为SjMP13基因。 3．SjMP13的识别、克隆、重组表达及其抗原性鉴定结果 3．1成功扩增出了SjMP13；目的片段与T-载体连接后，经提取质粒，PCR、双酶切和DNA测序鉴定，确定目的片段与T-载体连接成功；将pET28a-SjMP13连接产物进行PCR、双酶切和DNA测序鉴定，确定重组质粒pET28a-SjMP13也成功构建；重组质粒pET28a-SjMP13经IPTG诱导后表达了重组蛋白，经SDS-PAGE显示与理论预测的融合蛋白分子量(SjMP13 13kDa+担体蛋白4.1kDa=17.1kDa)偏大，约23kDa。且该条带可被血吸虫病人血清识别，提示重组表达的蛋白具有抗原性。 3．2重组固MP13的抗原性研究：采用重组两MP13作抗原用于间接ELISA检测，28份血吸虫患者血清均为阳性，15份正常人血清均为阴性，20份华支睾吸虫感染者血清也均为阴性，但检测20例乙肝感染者血清，出现6份阳性，假阳性率为30﹪。采用SEA作对照，28份血吸虫患者血清均为阳性，15份正常人血清均为阴性，20份华支睾吸虫感染者血清出现2份阳性(假阳性率10﹪)，20例乙肝感染者血清中也出现6份阳性(假阳性率为30﹪)。 研究结论 采用免疫学筛选、PCR技术及生物信息学方法，从日本血吸虫虫卵cDNA文库中发现了一批具有潜在研究价值的血吸虫特异性抗原序列，其中SjMP13为毛蚴相关蛋白基因，经过构建原核表达载体pET28a-SjMP13，成功表达了re-SjMP13，Western blot和ELISA检测显示re-SjMP13具有与SEA相似的敏感性，且特异性高于SEA，提示re-SjMP13是一个理想的血吸虫病免疫诊断抗原分子，值得进一步的研究开发。