论文部分内容阅读
目的：内质网应激(ERS)是指多种生理和病理生理条件下，导致错误折叠/折叠蛋白在内质网(ER)腔内的积聚，从而对ER造成负担。越来越多的研究发现在类风湿关节炎(RA)患者CD4+CXCR5+ICOS+T细胞异常增多;而近年来也有大量研究表明同种异体间充质干细胞(MSC)可明显抑制RA滤泡辅助性T细胞(Tfh)的产生。然而ERS后的MSC对RA外周CD4+CXCR5+ICOS+T细胞的作用至今尚不明确。在本研究中，我们旨在探讨ERS后的MSC对RA外周CD4+CXCR5+ICOS+T细胞的调控作用。 方法：(1)采用组织贴壁法分离、培养足月妊娠正常分娩的健康胎儿脐带MSC，利用毒胡萝卜素(Tg)诱导MSC产生ERS。不同浓度（0.1μM、0.25μM、0.5μM、1μM）的Tg刺激MSC4小时后，采用CCK8法检测Tg对MSC的细胞毒性;(2)分别用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-P CR)和蛋白质免疫印迹法(WB)检测MSC ERS标志基因葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的mRNA和蛋白水平;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测X盒结合蛋白-1(XBP-1)。(3)利用密度梯度离心法分离、培养RA患者外周血单个核细胞(PBMC)，并用磁珠分选法分离出CD4+T细胞，将anti-CD3(浓度3μg/mL)、anti-CD28（浓度2μg/mL）活化的RA CD4+T细胞与Tg刺激或未刺激的MSC共培养72小时，流式细胞术检测外周血CD4+CXCR5+ICOS+T细胞百分比。(4)采用qRT-PCR检测Tg刺激4小时后MSC主要的可溶性细胞因子，包括环氧合酶-2(COX-2)、白细胞介素-6(IL-6)、吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)、肝细胞生长因子(HGF)和转化生长因子-β(TGF-β)mRNA表达情况;采用酶联免疫试验法(ELISA)检测MSC培养上清液中的主要可溶性因子进行验证。(5)收集共培养前后MSC和细胞上清，分别用qRT-PCR和ELISA检测COX-2/前列腺素E2(PGE2)和IL-6的mRNA和蛋白水平。(6)采用RT-PCR和流式细胞术检测CD4+T细胞上PGE2受体EP1-4的表达。(7)在共培养体系中分别加入EP2/EP4拮抗剂和IL-6R拮抗剂，流式细胞术检测CD4+CXCR5+ICOS+T细胞比例。 结果：(1)与未刺激的MSC相比，Tg(0.1μM～1μM)处理的MSC无细胞毒性现象，同时Tg(0.1μM～1μM)刺激的MSC其ERS标志基因GRP78表达明显升高(P＜0.05)，并具有剂量依赖性;另一个标志基因XBP-1由无活性的非剪切形式（XBP-1u）转变为具有活性形式的剪切状态(XBP-1s)。(2)与单独CD4+T细胞相比相比，MSC与RA CD4+T细胞共培养72小时后，RA患者外周血CD4+CXCR5+ICOS+T细胞比例明显下降(P＜0.05)，而与MSC与RA患者外周血CD4+T细胞共培养组相比，Tg刺激后的MSC与CD4+T细胞共培养后72小时后，RA患者外周血CD4+CXCR5+ICOS+T细胞比例下降程度更明显(P＜0.01)。(3)与Tg未处理的MSC相比，qRT-PCR及ELISA结果显示，Tg刺激的MSC其主要可溶性细胞因子PGE2和IL-6表达明显升高，具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.05);而IDO、TGFβ、HGF表达无明显差异(P＞0.05，P＞0.05);此外与MSC与RA患者外周血CD4+T细胞共培养组相比，Tg刺激后的MSC与CD4+T细胞共培养后72小时后，qRT-PCR及ELISA结果显示共培养体系中PGE2和IL-6明显升高，并具有统计学意义。(4)RT-PCR及流式细胞术结果显示，EP2和EP4表达于CD4+T细胞，而EP1/EP3不表达于CD4+T细胞。(5)在Tg处理后的MSC与RA患者外周血CD4+T细胞共培养体系中分别加入EP2/EP4拮抗剂、IL-6R拮抗剂，流式细胞术结果提示分别加入EP2/EP4拮抗剂共培养72小时后，CD4+CXCR5+ICOS+T细胞百分比较未加拮抗剂的共培养组明显升高，并具有统计学意义(P＜0.01;P＜0.01);而加入IL-6R拮抗剂的共培养组无明显变化(P＞0.05)。 结论：ERS后的MSC通过升高的PGE2与其受体EP2/EP4结合下调RA患者外周血CD4+CXCR5+ICOS+T细胞百分比。我们的实验研究重点是如何改善MSC的免疫调节作用，为MSC在RA治疗中的应用提供支持。