鹿儿岛被毛孢对家蚕侵染方式及粘液功能研究

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被毛孢属(Hirsutella Patouillard,1892)真菌是一类寄主广泛,全球性分布的节肢动物和线虫病原真菌,经常引起寄主的流行病从而大量消减寄主的种群数量,其生态价值受到学界广泛关注。近年研究结果表明,被毛孢是暗色虫草亚属真菌Ophiocordyceptea Sung的无性阶段,由于虫草是亚洲很多国家的传统药物使得该属真菌的药用活性物质研究也受到关注。被毛孢类真菌资源在控制节肢动物种群维持生态系统平衡以及医药、生物活性物质开发方面有重要价值,因此研究该属真菌资源有重要意义。本文以鹿儿岛被毛孢(Hirsutella satumaensis Aoki)和家蚕(Bombyx moriLinnaeus.)为材料进行了如下研究:  1.对鹿儿岛被毛孢(Hirsutella satumaensis)进行了重新描述和鉴定,并向GenBank提交了该菌的两条ITS序列KJ913066和KJ913067,补充了该种相关分子的系统学资料;并对该菌进行了生长周期测定以及该菌产孢条件的初步优化。该菌生长周期较长,接种10 d后开始形成芽孢子,20 d后达到稳定期;较优产孢条件为:蛋白胨3%,葡萄糖1%,蚕蛹粉1.5%,维生素B11%,硫酸镁0.05%,磷酸二氢钾0.1%,琼脂2%,蒸馏水1000 ml,25℃。方差分析结果表明,四个因素中蚕蛹粉对单位产孢量有显著性影响。  2.对鹿儿岛被毛孢(H. satumaensis)分生孢子孢外黏液层的洗脱条件进行了研究。较优洗脱条件为:采用pH8.0磷酸钠缓冲液进行孢子洗脱,洗脱液放入含玻璃珠的50 mL三角瓶,100 rpm/min低速旋转10 min,使菌丝和孢子充分分散,4层擦镜纸过滤,将菌丝等杂质过滤。滤液中再加入浓度为0.5%的β-巯基乙醇做保护剂后置于4℃下,玻璃棒轻搅20 min提取黏液;10000 rpm/min高速离心5min分离孢子和上清液。将洗脱粘液后孢子于扫描电镜下观察,与正常具黏液孢子相比,该方法能将粘液层较为完整地洗脱下来。对磷酸钠缓冲液洗脱粘液中蛋白质含量进行了测定,含量为0.105 mg/mL,说明粘液层主要成分中有蛋白质;对洗脱液上清液进行了液质联用初步分析,结果显示主成分较多,无法比对鉴定,需将主成分分离纯化后再进行鉴定;研究了孢外黏液层在对该菌生长、侵染寄主过程中的影响,结果显示粘液层有保护孢子、适应环境及有助对寄主表面粘附、提高毒力的作用。  3.采用鹿儿岛被毛孢(H. satumaensis)对寄主家蚕的侵染方式进行了研究。使用正常和脱粘液后两种孢子,通过血体腔注射、体表接触、孢子喂食、体表接触与孢子喂食双重处理,以家蚕平均体重、体长作为衡量指标,H. satumaensis对家蚕的生理生长有一定抑制影响,但各处理组均未出现被该菌感染致死的僵蚕,不具统计意义;孢子经血体腔注射萌发实验表明,该菌株对家蚕有毒力退化现象,因而不能判定该菌对寄主有多种侵染途径;设计该菌特异性引物对处理后家蚕蚕卵进行检测,与对照相比,该菌在家蚕基因组中无法检测出来,说明该菌在家蚕中的初始表达极微量或是该菌不能通过垂直传播方式进行侵染。
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