背景异丙酚是一种广泛应用于临床麻醉诱导和维持以及重症患者镇静的静脉麻醉药。一系列的研究表明异丙酚具有抗炎抗氧化的特性：可以减少促炎因子的生成包括肿瘤坏死因子a(tumor necrosis factor-a,TNF-a)以及活性氧簇的产生,减少氧自由基的形成,减低脂质的过氧化和抑制血小板的聚集等。然而异丙酚的具体的抗炎机制仍然不是很明确。高密度脂蛋白具有心血管保护效应,包括促进胆固醇的逆向转运,抗炎和抗氧化特性等。载脂蛋白M(Apolipoprotein M,apoM)是最近发现的与高密度脂蛋白密切相关的脂蛋白家族成员。研究表明apoM是一种负向快速反应蛋白能够发挥减少感染和炎症反应的作用。外界刺激诱发炎症反应发生时,能够减少肝脏和肾脏的apoM的mRNA水平和血清中apoM的分泌,同时也能引起Hep3B细胞apoM的分泌减少。此外,在人类,急性细菌感染或者慢性HIV感染后,血清中的apoM表达水平均降低。研究表明apoM表达受多种因素调控,其中包括转录因子肝细胞核因子1α(Hepatocyte Nuclear Factor la,HNF-1α)。研究表明, HNF-1α有一个稳定的apoM结合位点,可与apoM增强子区域相结合,这对于肝脏和肾脏的apoM表达是必须的；HNF-1α缺乏的大鼠组织器官和血浆中均检测不到apoM的mRNA表达；肝脏HNF-1α缺陷的大鼠血浆中的apoM表达浓度仅仅是野生型大鼠的一半；早发糖尿病患者由于HNF-1α基因突变血浆中的apoM表达也显著降低。此外研究表明HNF-1α的表达和功能也受到促炎因子的调节：细菌脂多糖(Lipopoly saccharide, LPS)处理后HNF-1α的mRNA水平和蛋白水平以及结合活性都显著下调。然而,异丙酚是否能影响HNF-1α和apoM的表达还不清楚,HNF-1α和apoM是否可以介导异丙酚抑制LPS诱导的炎症反应还不是很清楚。本研究通过细胞实验和动物实验,观察异丙酚对炎症反应,以及对(?)SNF-1α和apoM的表达的影响并探讨其相关机制。目的1、观察异丙酚对脂多糖诱导处理的C57BL/6小鼠肝脏组织中apoM和HNF-1α表达的影响。2、观察异丙酚对脂多糖诱导处理的HepG2细胞中的apoM和HNF-1α表达的影响。3、观察HNF-1α是否参与异丙酚调节脂多糖诱导处理的HepG2细胞中apoM的表达。4、观察异丙酚对脂多糖诱导处理的THP-1细胞的炎症反应的影响。5、观察apoM是否参与异丙酚抑制脂多糖诱导处理的THP-1细胞的炎症反应。材料和方法1、材料1.1药品异丙酚(2,6-二异丙基苯酚)和细菌脂多糖(from Escherichia coli055:B5)均购买自Sigma公司(美国)。RNA逆转录试剂盒(The PrimeScript RT Reagent kit, DRR037A)和实时荧光定量PCR试剂盒(the SYBR■Premix Ex TaqTM II kit,DRR820A)均购自于TaKaRa公司(日本)。其他化学试剂均为医药级别,均来自于试剂供应商。1.2动物选取8周龄,雌性C57BL/6小鼠80只,均购买于北京大学实验动物中心,平均体重为20克。随机分为四组每组20只(1)对照组(control组)-腹腔注射磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH7.4);(2)细菌脂多糖组(LPS组)-腹腔注射5mg/kg细菌脂多糖；(3)异丙酚组(Prop组)-腹腔注射10mg/kg异丙酚；(4)细菌脂多糖+异丙酚组(LPS+Prop)-腹腔注射5mg/kg细菌脂多糖和10mg/kg异丙酚。所有的动物每五只放在同一笼饲养,室温维持在25℃,采用12h昼夜循环。实验动物购买,饲养以及动物实验程序均得到南方医院实验动物中心批准。1.3细胞培养人肝癌组织细胞(HepG2)和人急性单核白血病细胞(THP-1)均购买于American Type Culture Collection(美国弗吉尼亚州,马纳萨斯)。HepG2细胞生长于370C,5%CO2,含有10%新生胎牛血清的DMED培养基中,培养箱中静置培养,取对数生长期细胞进行实验。THP-1细胞生长于37℃,5%CO2,含有10%新生胎牛血清的RPMI-1640培养基中,培养箱中静置培养。取对数生长期细胞进行实验,在每次实验前用100nM佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate,PMA)5%C2,370C孵育THP-1细胞72h,诱导使其分化成巨噬细胞,细胞贴壁分别接种到6孔板、12孔板或者60毫米培养皿中,等到细胞生长到汇合度为80-90%时进行处理。在实验前用PBS清洗两次,最后一次用不含抗体的无血清的PBS冲洗。2、方法2.1RNA分离提取和实时定量PCR(real-time PCR)根据Invitrogen公司RNA提取试剂盒操作说明提取小鼠组织或培养细胞中的总RNA。然后将1μg总RNA用逆转录试剂盒(TaKaRa)反转录成20μl的cDNA。实时荧光定量PCR在应用生物系统ABI7500FAST上进行。溶解曲线分析表明PCR反应产物为单独的双链DNA。采用△△Ct值法,以GAPDH表达为内参定量其它基因的表达。2.2Western blot分析根据总蛋白提取试剂盒说明书提取小鼠组织和培养细胞的总蛋白,采用BCA法蛋白定量试剂盒(KeyGen Biotechnologies,中国南京)进行蛋白定量。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,每个点样孔30μg总蛋白。蛋白质转膜后,孵育一抗。采用兔抗apoM多克隆抗体(BD Biosciences, San Jose, CA,美国),兔抗iNOS多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.Santa Cruz,CA,美国),兔抗HNF-1α多克隆抗体和兔抗β-actin-单克隆抗体(Abcam, Cambridge, MA,美国)。孵育结束后以HRP-兔抗山羊IgG二抗进行孵育,再采用化学荧光蛋白显色方法(ECL Plus Western Blot Detection System;Amerisham Biosciences,Foster City,CA,美国)进行显色曝光。2.3细胞因子检测采用100nmol/L氟波脂(PMA)诱导孵育THP-1细胞72小时使其分化成巨噬细胞,分别经细菌脂多糖,和脂多糖联合异丙酚处理。收集细胞上清分别采用酶联免疫分析试剂盒(Amersham Biosciences)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-a),白细胞介素-1β (IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)的表达情况。2.4小分子干扰RNA(siRNA)转染特异性siRNA-HNF-1α和siRNA-apoM的RNA干扰片段以及长度为21个核苷酸的siRNA阴性对照片段均购自广州锐博生物科技有限公司。采用脂质体2000(Invitrogen)转染培养细胞(2×106/well)。转染48小时后采用实时定量PCR和western blot检测目的基因mRNA和蛋白表达情况。2.5重组质粒构建包含HNF-1α的PCR-XL-TOPO载体和PIRES2-EGFP载体购自Invitrogen公司。在HNF-1α上游添加EcoRI酶切位点扩增得到EcoRI-HNF-1α片段；在EGFP下游添加：Xhol酶切位点,在上游添加IRES连接基因,扩增得到IRES-EGFP-XhoI。进行PCR反应,PCR反应结束后,分别凝胶电泳回收EcoRI-HNF-la和IRES-EGFP-XhoI目的条带。通过重叠PCR将上述两个片段进行连接,合成含有目的基因HNF-la和EGFP的片段EcoRI-HNF-1a-IRES-EGFP-XhoI.重叠PCR反应结束后凝胶电泳回收EcoRI-HNF-1α-IRES-EGFP-XhoI的目的条带。双酶切上述重叠PCR的回收产物与pCDNA3.1(+)载体。并采用连接酶切回收的HNF-1α-IRES-EGFP片段和pcDNA3.1(+)载体。再将感受态大肠杆菌DH5α解冻后与含重组质粒连接反应液充分混合进行重组质粒的转化。利用PCR及酶切鉴定重组质粒,并用测序引物作测序鉴定。鉴定正确无误后,利用超纯质粒试剂盒提取pcDNA3.1-HNF-1α以备使用。采用脂质体2000将pcDNA3.1-HNF-1α转染目的基因。结果1、异丙酚对脂多糖诱导处理的小鼠肝脏组织中apoM和HNF-1α表达的影响采用实时定量PCR检测各组各时间点apoM和HNF-1α的mRNA表达,析因分析结果表明,对于apoM和HNF1α的mRNA表达,不同处理组和各处理组不同处理时间之间存在交互效应(F=141.603,P=0.000;F=118.214,P=0.000)。经脂多糖处理后,6小时,12小时和24小时apoM的mRNA表达水平均显著下调,与0小时比较差异有统计学意义(P=0.000；P=0.000；P=0.000)；异丙酚处理后,6小时,12小时和24小时apoM的mRNA表达水平均显著上调,与0小时比较差异有统计学意义(P=0.000；P=0.000；P=0.000)；经脂多糖和异丙酚联合处理后,6小时,12小时和24小时apoM的mRNA表达水平改变,与0小时比较差异没有统计学意义(P=1.000；P=1.000；P=0.732)。经脂多糖处理后,6小时,12小时和24小时HNF-1α的mRNA表达水平均显著下调,与0小时比较差异有统计学意义(P=0.000；P=0.000；P=0.000)；异丙酚处理后,6小时,12小时和24小时HNF-1α的mRNA表达水平均显著上调,与0小时比较差异有统计学意义(P=0.000；P=0.000；P=0.000)；脂多糖和异丙酚联合处理后,6小时,12小时和24小时HNF-1α的mRNA表达水平改变,与0小时比较差异没有统计学意义(P=1.000；P=1.000；P=1.000)。而且脂多糖对apoM和HNF-1α的mRNA表达抑制作用在24小时最强(41.400±7.301vs100.200±4.207,P=0.000;38.400±8.019vs100.200±9.257,P=0.000);异丙酚对apoM和HNF-1α的mRNA表达增强作用也具有时间依赖性,随着时间延长而增强,在24小时增加最明显(256.400±8.355vs99.200±8.438,P=0.000；288.800±13.255vs99.800±9.203,P=0.000)。采用western-blot检测各处理因素处理24小时后,各组apoM和HNF-1α的蛋白表达：脂多糖处理后,apoM和HNF-1α的蛋白表达水平均显著下调,与对照组比较差异有统计学意义(P=0.000,P=0.000)；异丙酚处理后,apoM和HNF-1α的蛋白表达水平则均显著上调,与对照组比较差异有统计学意义(P=0.000,P=0.000)；脂多糖和异丙酚联合处理后,apoM和HNF-1α的蛋白表达水平改变,与对照组比较差异没有统计学意义(P=0.079,P=0.090)。2、异丙酚对HepG2细胞apoM和HNF-1α表达的影响由于apoM和HNF-1α在小鼠肝脏组织中的表达受脂多糖的负向调节,并且apoM的表达受HNF-1α的直接调节。‘我们通过实时定量PCR方法检测脂多糖和异丙酚对HepG2细胞apoM和HNF-1α表达的影响：脂多糖诱导处理后,apoM的mRNA表达在6h,12h和24h均显著下调,与0小时比较差异有统计学意义(P=0.048；P=0.002；P=0.000):HNF-1α的mRNA表达在6h,12h和24h也均显著下调,与0小时比较差异有统计学意义(P=0.019；P=0.000；P=0.000)；异丙酚处理后,apoM的mRNA表达在6h,12h和24h均显著上调,与0小时比较差异有统计学意义(P=0.016；P=0.000；P=0.000):HNF-1α的mRNA表达在6h,12h和24h也均显著上调,与0小时比较差异有统计学意义(P=0.042;P=0.000;P=0.000)。然后我们采用westem blot方法检测脂多糖和异丙酚对HepG2细胞apoM和HNF-1α蛋白表达的影响：脂多糖处理后,apoM的蛋白表达水平在6h,12h和24h均显著下调,与0小时比较差异有统计学意义(P=0.043；P=0.001；P=0.000);HNF-1α的蛋白表达水平在6h,12h和24h均显著下调,与0小时比较差异有统计学意义(P=0.030；P=0.000；P=0.000)。相反,当异丙酚处理后,apoM的蛋白表达水平在6h,12h和24h均显著上调,与0小时比较差异有统计学意义(P=0.004;P=0.000;P=0.000);HNF-1α的蛋白表达水平在6h,12h和24h也均显著上调,与0小时比较差异有统计学意义(P=0.000；P=0.000；P=0.000)。3、异丙酚通过HNF-1α途径调节HepG2细胞的apoM表达首先采用HNF-1α-siRNA转染HepG2细胞,使转染后的HepG2细胞的HNF-la表达降低。Western blot结果显示与对照组比较,siRNA组HNF-1α的表达下降达到89%(0.113±0.060vs1.003±0.096),差异有统计学意义(F=115.062,P=0.000)。然后检测异丙酚对HNF-la-siRNA转染后的HepG2细胞apoM蛋白表达的影响：实验分组如下：对照组：0μM异丙酚+0ng/ml脂多糖,LPS组：10ng/m1脂多糖,Prop组：50μM异丙酚,LPS+Prop组：50μM异丙酚+10ng/ml脂多糖。在经过negative control处理的HepG2细胞中,LPS组apoM蛋白表达水平显著下调,与对照组比较差异有统计学意义(P=0.006);Prop组apoM蛋白表达水平显著上调,与对照组比较差异有统计学意义(P=0.000)；LPS+Prop组apoM蛋白表达水平与对照组比较差异没有统计学意义(P=1.000)。在HNF-1α的表达被HNF-1α-siRNA干扰后,LPS组apoM蛋白表达水平显著下调,与对照组比较差异有统计学意义(P=0.005);Prop组apoM蛋白表达水平改变与对照组比较差异没有统计学意义(P=0.623);LPS+Prop组apoM蛋白表达水平显著下调,与对照组比较差异有统计学意义(P=0.012)。接下来,我们采用HNF-1α重组过表达质粒使HNF-1α表达增加,观察异丙酚对于HepG2细胞apoM蛋白表达的影响。用重组过表达质粒上调HNF-1α的表达可以达到613%(6.137±0.172vs1.007±0.131),与对照组比较差异有统计学意义(F=1337.813,P=0.000)。重组过表达质粒转染的HepG2细胞,实验分组如下：对照组：OμM异丙酚+0ng/ml脂多糖,LPS组：lOng/ml脂多糖,Prop组：50μM异丙酚,LPS+Prop组：50μM异丙酚+10ng/ml脂多糖。Prop组apoM的表达被显著上调,与对照组比较差异有统计学意义(P=0.000); LPS+Prop组apoM的表达被显著上调,与对照组比较差异有统计学意义(P=0.000); LPS组的apoM的表达水平变化,与对照组比较差异没有统计学意义(P=1.000)。4、异丙酚抑制THP-1巨噬细胞的炎症反应将THP-1巨噬细胞随机分为四组：Control组：0μM异丙酚+0ng/mlLPS, LPS组：10ng/mlLPS, Prop组：50μM异丙酚,LPS+Prop组：50μM异丙酚+10ng/mlLPS分别孵育24小时。结果,LPS组apoM的蛋白表达水平显著下调,与对照组比较差异有统计学意义(P=0.003); Prop组apoM的蛋白表达水平显著上调,与对照组比较差异有统计学意义(P=0.000); LPS+Prop组apoM的表达水平改变,与对照组比较差异没有统计学意义(P=1.000)。同样,脂多糖诱导处理后,LPS组HNF-1α的蛋白表达水平显著下调,与对照组比较差异有统计学意义(P=0.012); Prop组HNF-1α蛋白表达水平显著上调,与对照组比较差异有统计学意义(P=0.000); LPS+Prop组HNF-1α的蛋白表达水平改变,与对照组比较差异没有统计学意义(P=0.555)。接下来用western blot方法检测了iNOS蛋白表达水平,结果：LPS组iNOS的蛋白表达水平显著上调,与对照组比较差异有统计学意义(P=0.000);Prop组iNOS的蛋白表达水平改变,与对照组比较差异没有统计学意义(P=1.000);LPS+Prop组iNOS的蛋白表达水平显著上调,与LPS组比较差异有统计学意义(P=0.000)。之后我们采用ELISA方法检测THP-1巨噬细胞中炎症因子TNF-α,IL-1β和IL-6的表达变化。实验分组如下,Control组：0μM异丙+0ng/mlLPS,LPS组：10ng/mlLPS,Prop组：50μM异丙酚,LPS+Prop组：50μM异丙酚+10ng/mlLPS,分别孵育24小时。ELISA结果：LPS组TNF-α, IL-1β和IL-6的表达水平显著增加,与对照组比较差异有统计学意义(P=0.000,P=0.000,P=0.000);Prop组TNF-α,L-1β和IL-6的表达水平改变,与对照组比较差异没有统计学意义(P=1.000,P=1.000,P=1.000);LPS+Prop组的TNF-α,IL-1β和IL-6的表达水平显著下降,与LPS组比较差异有统计学意义(P=0.000,P=0.000,P=0.000)。5、异丙酚通过apoM途径抑制THP-1巨噬细胞的炎症反应采用apoM-siRNA转染THP-1巨噬细胞,经过apoM-siRNA处理的THP-1巨噬细胞apoM的蛋白表达下降了86%(0.140±0.076vs1.003±0.086),与对照组比较差异有统计学意义(F=97.836,P=0.000)。实验分组如下,处理因素：Control组：OμM异丙酚+0ng/ml脂多糖,LPS组：10ng/m脂多糖,Prop组：50μM异丙酚,LPS+Prop组：50μM异丙酚+10ng/ml脂多糖,分别孵育24小时。首先检测iNOS的蛋白表达：negative control处理条件下,THP-1巨噬细胞中,LPS组iNOS蛋白表达水平显著上调,与对照组比较差异有统计学意义(P=0.000); Prop组iNOS蛋白表达水平改变,与对照组比较差异没有统计学意义(P=1.000)；LPS+Prop组iNOS的蛋白表达水平显著下调,与对照组比较差异有统计学意义(P=0.000),与LPS组比较差异有统计学意义(P=0.000)。在apoM-siRNA转染的THP-1巨噬细胞,LPS组iNOS蛋白表达水平显著上调,与对照组比较差异有统计学意义(P=0.000), Prop组iNOS蛋白表达水平改变,与对照组比较差异没有统计学意义(P=1.000);LPS+Prop组iNOS蛋白表达水平显著上调,与对照组比较差异有统计学意义(P=0.000),与LPS组比较差异没有统计学意义(P=0.843)。接下来将被apoM-siRNA和negative control转染的THP-1巨噬细胞随机分为五组(1)Control组,(2)siRNA-NC+异丙酚(50μM)组,(3)siRNA-apoM+异丙酚(50μM)组,(4)siRNA-NC+异丙酚(50μM)+脂多糖(10ng/ml)组,(5)siRNA-apoM+异丙酚(50gM)+脂多糖(10ng/ml)组,五组细胞分别在37℃孵育24小时。采用ELISA方法分析各组炎症因子TNF-a,IL-1β和IL-6的表达情况。异丙酚与脂多糖联合处理用apoM-siRNA转染的THP-1巨噬细胞后,TNF-α、IL-1p和IL-6的表达均被升高,与siRNA-NC+异丙酚+脂多糖组比较差异有统计学意义(P=0.000,P=0.000,P=0.000)。结论1、异丙酚可以上调C57BL/6小鼠肝脏组织中的apoM和HNF-1α的mRNA和蛋白表达水平,并且具有时间依赖性。2、异丙酚可以上调HepG2细胞的apoM和HNF-1α的mRNA和蛋白表达水平,并且具有时间依赖性。3、异丙酚通过HNF-1α途径上调HepG2细胞的apoM的表达。4、异丙酚能够抑制THP-1巨噬细胞的炎症反应。5、异丙酚通过apoM途径抑制THP-1细胞的炎症反应,发挥抗炎作用。