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研究背景:前列腺癌是西方国家最常见的恶性肿瘤,其发病率居西欧国家男性恶性肿瘤的第二位,死亡率位于男性恶性肿瘤患者的首位。我国前列腺癌的发病率虽然远低于西方国家,但是近年来我国前列腺癌的检出率和发病率呈直线上升趋势,已位居泌尿系肿瘤的第三位,甚至第二位。并且一半以上前列腺癌患者确诊时已经是所谓的局部进展性和转移性前列腺癌,失去根治性手术治疗机会,只能采用雄激素阻断为主的内分泌综合治疗,多数患者会逐渐转变为雄激素非依赖型前列腺癌,而该类前列腺癌对化疗的应答率低。总的来说,目前对该类患者的治疗总体疗效较差,雄激素依赖型前列腺癌向雄激素非依赖型前列腺癌的转变,以及雄激素非依赖型前列腺癌的治疗成为目前研究的焦点。Sorafenib(Nexavar,Bayer-Onyx BAY 43-9006)是一种小分子双芳香基碳酰胺,最初被认为是一种口服的抑制Raf激酶的小分子激酶抑制剂,随后的研究表明Sorafenib能抑制VEGFR-2,VEGFR-3,PDGFR-b等多个生长因子受体激酶,也能降低RET和BCL-2的表达,Sorafenib还能够降低Mcl-1蛋白水平和eIF4E磷酸化水平,是一种多靶点抑制剂。系列体外和体内实验研究表明Sorafenib能抑制肾癌、黑色素瘤、肺癌、肝癌等多种肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡。Sorafenib作为一种靶向作用于Raf激酶与血管生成的抑制剂,还被视为无耐药性的新型抗癌药物,并且可以逆转或部分逆转这些肿瘤细胞P糖蛋白(p-glycoprotein,p-gp)介导的多药耐药(multidrug resistance,MDR)。目前的研究认为前列腺癌雄激素依赖向雄激素非依赖的转变及前列腺癌对化疗的低应答率均与前列腺癌的MDR现象有重要关系。本课题采用光镜和电镜,流式细胞技术,MTT等技术从细胞水平观察Sorafenib对体外培养的前列腺癌雄激素非依赖型细胞株DU145细胞增殖和凋亡的影响;用Western-blot法检测DU145细胞增殖和凋亡的关键蛋白表达变化,初步探讨Sorafenib体外抑制DU145细胞增殖、诱导DU145细胞凋亡的机制;用MTT技术观察DU145/ADM细胞增殖,以及RT-PCR和Western-blot的方法检测MDR-1基因mRNA及其产物p-gp蛋白表达来评价Sorafenib对DU145/ADM细胞的MDR的逆转作用。第一部分Sorafenib抑制DU145细胞增殖及诱导DU145细胞凋亡的实验研究目的观察Sorafenib对雄激素非依赖型前列腺癌DU145细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。方法以不同浓度的Sorafenib作用于体外培养的DU145细胞不同时间,用显微镜和透射电镜观察细胞形态学和超微结构变化,MTT法观察细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡变化。结果0.5、1、2、5、10、15、20μmol/L Sorafenib作用DU145细胞24h、48h、72h后对DU145细胞增殖均有抑制作用,除0.5μmol/L组作用24h与对照组无显著差异外(P=0.64),其他各组之间均有显著差异(P＜0.05),抑制呈现时间和剂量依赖关系。Sorafenib能引起DU145细胞典型的凋亡形态学改变:细胞体积缩小,细胞核固缩、裂解、核碎片及凋亡小体形成。0、2、5、7、10、15umol/L Sorafenib作用48h后,DU145细胞G1期细胞数比例分别为45.4%、51.7%、55.0%、63.7%、67.0%、74.7%,凋亡细胞率分别为0.28%、7.6%、11%、18.5%、23.2%、28.4%。结论Sorafenib能抑制体外培养的雄激素非依赖型前列腺癌DU145细胞增殖,并呈现时间和剂量依赖关系;Sorafenib能阻滞DU145细胞于G1期,诱导DU145细胞凋亡,有剂量依赖关系。第二部分Sorafenib抑制DU145细胞增殖及诱导DU145细胞凋亡的机制目的探讨Sorafenib抑制雄激素非依赖型DU145细胞株细胞增殖、阻滞DU145细胞周期及诱导DU145细胞凋亡的机制。方法分别用5umol/L、10umol/L、15umol/L浓度的Sorafenib作用DU145细胞相应时间后,用Western—blot方法检测DU145细胞t-ERK、p-ERK、t-AKT、p-AKT、PTEN、BCL-2、cyclinD1蛋白的表达变化。结果Sorafenib作用2h后,DU145细胞t-ERK、t-AKT、p-AKT与对照组比较无变化,而p-ERK随着Sorafenib作用剂量增加,磷酸化水平逐渐降低;Sorafenib作用24h后,t-ERK、t-AKT无变化,而p-ERK、p-AKT随着Sorafenib作用剂量增加磷酸化水平逐渐降低;Sorafenib作用24h后,随着Sorafenib作用剂量增加,BCL-2、cyclinD1蛋白的表达逐渐减少,而PTEN蛋白表达逐渐增加。结论Sorafenib所致的p-ERK、p-AKT、BCL-2、cyclinD1表达下调,诱导PTEN表达上调可能是Sorafenib抑制雄激素非依赖型DU145细胞株细胞增殖、阻滞DU145细胞周期及诱导DU145细胞凋亡的主要作用机制。第三部分Sorafenib对DU145/ADM细胞阿霉素化疗敏感性影响的研究目的观察Sorafenib对DU145/ADM(耐AMD的DU145细胞)细胞阿霉素化疗敏感性的影响。方法用MTT法观察Sorafenib和阿霉素合用对DU145细胞增殖的抑制作用;分别用MTT法检测Sorafenib作用前后阿霉素对DU145/ADM增殖的抑制、RT-PCR法检测Sorafenib作用前后DU145/ADM细胞MDR-1基因mRNA的表达水平、Western-blot法检测Sorafenib作用前后DU145/ADM细胞p-gp的表达水平来观察Sorafenib对DU145/ADM的MDR的逆转作用。结果Sorafenib和阿霉素联合用药对DU145细胞增殖的抑制率高于Sorafenib和阿霉素分别单独作用DU145细胞的抑制率(P＜0.01);阿霉素对经Sorafenib处理后的DU145/ADM的抑制率显著高于Sorafenib处理前的抑制率(P＜0.05);经Sorafenib处理后,DU145/ADM对阿霉素的敏感性是处理前的2.16倍;经Sorafenib处理后,DU145细胞MDR-1基因mRNA及其产物p-gp的表达水平显著下调。结论Sorafenib能有效逆转p-gp介导雄激素非依赖型前列腺癌的MDR,其逆转机制可能主要通过下调MDR-1基因mRNA水平和p-gp蛋白的表达,PTEN、BCL-2、Raf/MER/ERK信号通路可能参与了逆转过程。Sorafenib与阿霉素同时作用于雄激素非依赖型前列腺癌DU145细胞时,两者表现协同作用,抑制DU145细胞增殖的效果显著增强。