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研究背景:肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。目前,尽管肺癌临床治疗取得了巨大的进展（包括靶向治疗和免疫疗法等）,使患者生存期显著延长,但是肺癌转移或耐药导致治疗失败的问题仍然没有完全解决。转移和耐药已经成为肺癌存活率持续低下的直接因素,其根本原因在于分子机制尚未阐明,缺乏针对性的治疗手段。近年来众多研究表明,肺癌转移与转录重编程高度相关。STAT3（Signal transducer and activator of transcription 3）是一种对多种信号响应的转录因子,在50%的肺癌患者肿瘤组织中持续激活。激活的STAT3可转录上调促转移靶基因,增强细胞的运动能力,但是具体的分子机制和信号过程尚未完全阐明。而在肺癌耐药的研究领域,则有大量研究关注调控细胞内稳态的细胞自噬在耐药中的关键作用。研究人员发现自噬受体SQSTM1（Sequestosome 1）在31%的肺癌患者肿瘤组织中表达升高,且与患者的存活时间呈负性相关,但是SQSTM1在肺癌耐药过程中的具体作用及调控方式仍不清楚。综上,深入研究转录重编程和自噬调控在肿瘤恶性演进中的关键作用,揭示STAT3、SQSTM1等关键分子的调控和作用模式,对于发现肺癌治疗的新靶点和新策略,进一步提升肺癌治疗效果,具有重大的理论意义和临床需求。AKR1C1（Aldo-keto reductase family 1 member C1）属于人类醛酮还原酶超家族成员,其已知的分子功能是催化醛类和酮类物质的还原反应。我们的前期研究发现AKR1C1在肺癌中表达显著上调,且与患者不良预后密切相关,可能具有促进肺癌转移的作用;此外,也有文献报道AKR1C1的过度表达与化疗药物的耐药密切相关。由此可见,AKR1C1在肺癌发展的过程中极有可能扮演了重要角色,深入探索其调控肺癌恶性演进的分子机制将有望为克服肺癌转移、耐药等常见的临床难题提供新的思路。本研究将分为两个部分:第一部分,AKR1C1以酶活非依赖方式调控STAT3促肺癌转移的机制研究;第二部分,AKR1C1通过自噬受体SQSTM1调控肺癌细胞自噬的作用及机制研究。第一部分AKR1C1以酶活非依赖方式调控STAT3促肺癌转移的机制研究研究目的:文献报道,磷酸化的STAT3可入核,并转录启动促转移靶基因MMP2（Matrix metallopeptidase 2）、SOX2（SRY-box transcription factor 2）、TWIST（Twist family bHLH transcription factor 1）等。尽管STAT3在50%的肺癌患者肿瘤组织中持续激活,其机制尚未完全阐明。我们第一部分的研究发现AKR1C1可通过调控STAT3的活性促肺癌的转移,并在此基础上进一步探索了AKR1C1的醛酮还原酶活性在此过程中扮演的角色。研究方法:采用免疫组化技术,考察肺癌患者肿瘤组织中蛋白的表达;采用苏木素和伊红染色,进行病理分析;采用Transwell和划痕技术,考察细胞的侵袭运动能力;运用正电子发射-计算机断层扫描（Positron emission tomography–computed tomography,PET-CT）成像技术,考察人肺癌细胞在裸鼠体内的肝转移能力;采用以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Oxidized form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP+）为辅酶,以四氢萘酚为底物的分光光度法,测定纯化蛋白AKR1Cs的醛酮还原酶活性;采用蛋白免疫印迹技术（Western blot,WB）,考察蛋白相对含量的变化;通过基因芯片,考察在肺癌细胞NCI-H460中敲低AKR1C1可能影响的信号通路;采用核质分离技术和免疫荧光技术,考察STAT3入核行为的变化;染色质免疫共沉淀联用聚合酶链式反应（Chromatin Immunoprecipitation coupled with Polymerase Chain Reaction,ChIP-PCR）,用于考察STAT3与靶基因启动子区域的结合能力;以STAT3为底物的体外激酶活性实验,用于考察AKR1C1是否具有蛋白激酶的功能;逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR,qRT-PCR）,用于考察AKR1C1及突变体对STAT3靶基因的影响;采用双荧光素酶报告基因检测实验,考察AKR1C1敲低和AKR1C1的酶活抑制剂3-溴-5苯基水杨酸（3-bromo-5-phenylsalicylic acid,5BPSA）对肺癌细胞STAT3转录活性的影响。研究结果:1、AKR1C1促进肺癌转移的功能确证:40例肺癌患者的原发灶组织与对应转移组织的免疫组化分析显示,AKR1C1在转移组织中表达上调;在高表达AKR1C1的肺癌细胞株中敲低AKR1C1,可减弱肺癌细胞的侵袭与运动能力;PET-CT结果显示,敲低AKR1C1可减弱肺癌细胞NCI-H460在裸鼠体内转移至肝脏的能力。2、AKR1C1促进肺癌转移的功能与酶活的关系:尽管AKR1C1/2/3具有类似的酶活功能,但是只有AKR1C1的表达与肺癌患者存活密切相关,且能促进肺癌细胞的转移;AKR1C1酶活抑制剂5BPSA不影响AKR1C1的促肺癌细胞转移的能力;酶活突变体组的细胞转移能力和野生型AKR1C1类似。3、AKR1C1激活STAT3信号通路:NCI-H460细胞的基因芯片以及qRT-PCR的结果显示,敲低AKR1C1可减弱STAT3的转录活性;在NCI-H460和SK-MES-1细胞中,敲低AKR1C1均减弱pY705-STAT3蛋白水平;核质分离和免疫荧光的结果显示,敲低AKR1C1减少核内的pY705-STAT3;染色质免疫共沉淀结果显示,AKR1C1促进STAT3蛋白结合到靶基因启动子区域;40例肺癌患者的肿瘤转移组织免疫组化分析结果显示,AKR1C1与pY705-STAT3的表达呈正相关;以STAT3为底物的体外激酶活性实验显示,AKR1C1无法直接诱导STAT3蛋白的磷酸化,不具有蛋白激酶的活性;通过siRNA敲低JAK2（Janus kinase 2）可降低AKR1C1引起的STAT3磷酸化水平;敲低JAK2可减弱AKR1C1的促转移能力;在NCI-H460细胞上的免疫共沉淀结果显示,敲低AKR1C1阻碍激酶JAK2与STAT3的结合。4、AKR1C1激活JAK2/STAT3信号通路与酶活无关:尽管AKR1C1/2/3具有类似的醛酮还原酶活性,但是只有AKR1C1与STAT3结合较强;AKR1C1的酶活突变体和野生型AKR1C1与STAT3的结合能力以及对STAT3的转录激活能力类似;双荧光素酶报告基因检测实验显示,5BPSA几乎不影响STAT3的转录活性。研究结论:AKR1C1以酶活非依赖方式激活STAT3信号通路,进而促进肺癌转移。在肺癌中,AKR1C1的表达与患者的预后密切相关。AKR1C1可通过与促转移转录因子STAT3的结合,调控激酶JAK2结合STAT3,增强STAT3的入核及对靶基因启动子区域的结合,进而加强STAT3的转录功能,最终推动肺癌的转移进程。第二部分AKR1C1通过自噬受体SQSTM1调控肺癌细胞自噬的作用及机制研究研究目的:最近的文献报道,自噬受体SQSTM1作为信号转导的中心,其相互作用蛋白是SQSTM1发挥功能的关键。质谱数据提示,AKR1C1是SQSTM1的潜在结合蛋白。因而,我们第二部分的研究将围绕AKR1C1与SQSTM1的结合,考察AKR1C1通过自噬受体SQSTM1调控肺癌细胞自噬的作用以及AKR1C1的酶活功能是否参与其中。研究方法:采用免疫共沉淀和蛋白质免疫印迹技术,考察AKR1C1和SQSTM1的结合;通过分子克隆和蛋白纯化技术,获得纯化蛋白GST-AKR1C1;通过点突变技术,构建不同位点突变的AKR1C1质粒;采用蛋白质免疫印迹技术,考察微管相关蛋白LC3B（Microtubule associated protein 1 light chain 3 beta）的变化;通过免疫荧光技术,观察LC3B和SQSTM1荧光颗粒的数量;采用非还原性蛋白质免疫印迹技术,考察SQSTM1寡聚化水平。研究结果:1、确证AKR1C1与SQSTM1的结合:外源性免疫共沉淀、半内源性免疫共沉淀和GST pulldown实验都可以检测到AKR1C1和SQSTM1的结合。2、AKR1C1/SQSTM1的结合与酶活的关系:尽管AKR1C1/2/3具有类似的酶活功能,但是只有AKR1C1与SQSTM1存在结合;AKR1C1的47位和54位或者170位和172位同时突变为AKR1C2时,AKR1C1与SQSTM1的结合消失;AKR1C1的酶活突变体和野生型AKR1C1与SQSTM1的结合能力类似;AKR1C1的酶活抑制剂5BPSA不影响SQSTM1与纯化蛋白GST-AKR1C1的结合。3、AKR1C1与SQSTM1结合的生理条件:在细胞水平,酶活抑制剂5BPSA能打断AKR1C1与SQSTM1的结合;双氧水（Hydrogen peroxide,H2O2）处理后,AKR1C1与SQSTM1的结合增强,而抗氧化剂可对抗H2O2引起的结合增强;自噬诱导缓冲液（Hank’s balanced salt solution,HBSS）处理后,AKR1C1与SQSTM1的结合逐渐增强。4、AKR1C1对肺癌细胞自噬的调控:Hela和NCI-H1299细胞中过表达AKR1C1增加细胞的LC3B-II蛋白水平;过表达AKR1C1同时用自噬溶酶体抑制剂氯喹（Chloroquine,CQ）处理的组别比单独用CQ处理的组别LC3B-II蛋白水平和LC3B荧光颗粒数量会进一步增加;过表达AKR1C1进一步增加自噬诱导过程中的LC3B-II蛋白水平和LC3B荧光颗粒数量。5、AKR1C1调控SQSTM1的功能:过表达AKR1C1可增强SQSTM1复合物的泛素化水平;AKR1C1增加SQSTM1-Myc蛋白与SQSTM1-Flag蛋白的结合;过表达AKR1C1进一步增加H2O2诱导的SQSTM1荧光颗粒数量;敲低AKR1C1减少H2O2诱导的SQSTM1荧光颗粒数量;在肺癌细胞NCI-H292中,敲低AKR1C1减少SQSTM1的寡聚化。研究结论:AKR1C1通过酶活非依赖的方式结合SQSTM1,调控肺癌细胞的自噬进程。在ROS应激下,AKR1C1与SQSTM1结合增强,促进自噬受体SQSTM1的寡聚化,增加SQSTM1与泛素化的自噬底物结合,推动自噬进程。