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丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是我国传统的大宗药材,在治疗心血管疾病、保护肝脏和抗菌消炎等方面效果显著,被广泛应用于国内外临床治疗。其次生代谢产物主要分为酚酸类化合物和丹参酮类化合物。其中丹酚酸B为酚酸类成分的代表,主要通过苯丙氨酸途径和酪氨酸途径合成。同时,多酚氧化酶为家族基因,丹参多酚氧化酶基因家族研究不完整。本课题组前期研究表明丹参多酚氧化酶(SmPPO,GenBank登陆号为KF712274)能正向调控丹酚酸B的积累,并且能够响应干旱胁迫,但响应机制并不清楚。本文通过生物信息学方法对丹参多酚氧化酶基因家族进行分析,结合分子生物学方法探索SmPPO互作蛋白,探索SmPPO基因与丹酚酸B合成途径的联系,进行相关试验得出以下结果:1.通过HMM Search法分别从中国中药数据库和昆明理工大学公布的丹参基因组中搜索多酚氧化酶基因家族成员,最终确定出丹参多酚氧化酶基因家族成员有26个。对丹参基因家族进行家族内进化分析和物种间进化分析,结果表明家族内进化分为三个亚家族,SmPPO在第三个亚家族,这三个亚家族在数量上有明显差异;在物种间多酚氧化酶家族进化中丹参与马铃薯、菠菜的进化关系较近,物种间多酚氧化酶进化树呈单子叶植物、双子叶植物、藓类、真菌的顺序进行排列。2.分别以丹参的根、茎、叶、花为材料提取RNA,后对SmPPO进行组织特异性表达分析,结果表明丹参多酚氧化酶主要在根和茎中表达,在花中少量表达,在叶中几乎不表达;以SmPPO序列为模板扩增序列,构建重组35S-1301-GFP亚细胞定位载体,通过农杆菌转染烟草后,在生物激光共聚焦显微镜下观察荧光,确定出SmPPO定位于细胞核、细胞膜和叶绿体上。3.以丹酚酸B合成路径中的关键酶和实验室前期酵母双杂交筛选出的可能与SmPPO互作的阳性蛋白的基因为模板,分别构建pGADT7的载体,后分别与pGBKT7-SmPPO进行共转化验证,结果表明酪氨酸氨基转移酶(GenBank登陆号为DQ334606.1,TAT)和苯丙氨酸解氨酶(GenBank登陆号为EF462460.1,PAL1)均与SmPPO互作;分别以SmPPO、TAT和PAL1基因的编码区构建重组p SPYNE(R)173载体和p SPYCE(M)载体,通过烟草注射法进行双分子荧光检测(BiFC)试验,结果显示只有TAT与SmPPO互作,PAL1并不与SmPPO互作。4.分析SmPPO和TAT的氨基酸序列,根据其结构域对SmPPO和TAT氨基酸序列进行截短,构建诱饵载体和猎物载体,分别进行共转化验证试验,结果表明SmPPO与TAT互作位点为SmPPO N端前126aa;截短的TAT结构域部分不与SmPPO全长互作,表明只有完整的TAT才能和SmPPO发生互作。5.分别对TAT、PPO-N端(前165aa)和PPO去N端部分(166aa-589aa)进行亚细胞定位分析,结果表明:TAT定位在细胞膜上;PPO-N端(前165aa)定位于细胞核、细胞膜、叶绿体上;PPO去N端部分(166aa-589aa)定位于叶绿体上,几乎没有在细胞膜表达,不在细胞核中表达。