【背景和目的】膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤，并呈增高趋势。2013年间大部分西方国家膀胱癌的发病率和病死率总体上有所降低，但是在东欧和发展中国家仍然呈增高趋势。一方面，膀胱癌诊断、治疗、复发监测和治疗相关并发症的费用在所有癌症中高达第七位，给患者造成重大的经济负担。另一方面，膀胱癌5年复发率高达50%~90%，约35%非肌层浸润性膀胱癌在复发时分期分级将会提高，其中10%-20%会进展为肌层浸润性癌，需行根治性膀胱全切和尿流改道术，且可能出现尿失禁、排尿困难和性功能障碍等并发症，严重影响患者社会活动能力和生活质量。因此有效治疗膀胱癌，降低复发风险是目前临床迫切需要解决问题。尿液修饰核苷作为非常有潜力的肿瘤标记物已发现对多种肿瘤的诊断、病情评估及预后预测意义重大。前期我们检测了膀胱癌患者尿液中的修饰核苷水平， m1A（1‐甲基腺苷）与1-meI（1‐甲基次黄苷）联合检测具有极高的灵敏度（92.45%）和特异性（87.50%）。因此，尿液修饰核苷检测有望成为有较高价值和广阔应用前景的膀胱癌肿瘤标志物并对膀胱癌复发进行有效的预后监测。尿液修饰核苷的主要来源是tRNA，肿瘤组织中tRNA修饰酶活性及其表达水平的增加是引起尿液修饰核苷增多的主要原因。数十年的研究证明，rRNA及tRNA转录后存在大量的修饰，参与转录后修饰的酶就多于100种，但对此的大规模功能学研究很少。大量文献报道恶性肿瘤细胞中存在高活性tRNA修饰酶。m1A58甲基转移酶（hTrm6p/hTrm61p）是人类体内修饰产生m1A的一种重要的酶，它是有两个亚基组成的异源四聚体，能够催化tRNA58位的腺苷（A）成为1-甲基腺苷（m1A）。tRNAs的转录后修饰对保持自身二级结构的稳定至关重要。这些转录后修饰也能够影响翻译的准确性、开放编码框的维持以氨基酰tRNA的识别。甲基化修饰是这些修饰中很常见的一种。位于tRNAs58位T环的A是非常保守核苷，A58N1位的甲基化修饰非常广泛，在真核生物、细菌及古细菌中均有发现。tRNAiMet58位A的甲基化修饰对其稳定性及酵母细胞的生长至关重要。hTrm61p亚基能够结合SAM（S-腺苷甲硫氨酸），并且两个亚基通过其N-端氨基酸序列及甲基化酶活性区域都参与了与目的tRNA的结合。hTrm6p/hTrm61p定位于细胞核内，在翻译的起始阶段起到至关重要的作用，因为tRNAiMet58位A的甲基化修饰对其稳定性至关重要。hTrm6p/hTrm61p对蛋白质的延伸阶段影响却很小。我们前期测定了膀胱癌组织及癌旁正常组织中hTrm6p/hTrm61p的水平，结果发现hTrm6p/hTrm61p在癌组织中明显高表达。提示hTrm6/hTrm61在膀胱癌发病机制中起到了重要作用，hTrm6/hTrm61可能促进了膀胱肿瘤的发病过程。本研究在前期工作的基础上进一步检测了癌组织及癌旁组织中hTrm6p/hTrm61p的一个亚基（hTrm61）mRNA水平；用荧光定量PCR技术（qPCR）对膀胱癌细胞株EJ、T24、5637及人胚胎肾脏细胞株HEK-293中hTrm61mRNA水平的检测，从EJ、T24、5637及HEK-293细胞株中筛选出hTrm61mRNA高表达细胞株；用siRNA干扰技术在5637细胞株中敲除hTrm61；用CCK-8法及流式细胞术进检测siRNA干扰hTrm61后膀胱癌细胞株5637增殖及凋亡的情况。【方法】选取经病理证实的膀胱尿路上皮癌患者23例；其中男性18例，女性5例；其中初发15例，复发8例；组织学分级之间（WHO1973）：级9例，П级8例，Ш级6例；浸润性癌12例，非侵润癌11例；手术为膀胱全切术或部分切除术；患者术前留取尿液，术中留取癌组织及癌旁组织；用荧光定量PCR（qPCR）方法检测膀胱癌患者组织标本癌组织及癌旁组织中hTrm61基因在mRNA上的表达水平。用荧光定量PCR技术（qPCR）对膀胱癌细胞株EJ、T24、5637及人胚胎肾脏细胞株HEK-293中hTrm61mRNA水平的检测，从EJ、T24、5637及HEK-293细胞株中筛选出hTrm61mRNA高表达细胞株；用siRNA干扰技术在5637细胞株中敲除hTrm61；用CCK-8法及流式细胞术进检测siRNA干扰hTrm61后膀胱癌细胞株5637增殖及凋亡的情况。【结果】1.用荧光定量PCR（qPCR）测定膀胱癌组织及癌旁正常组织中hTrm61mRNA的表达，结果显示：与癌旁正常组织相比，膀胱癌组织中hTrm61mRNA表达明显增高。 hTrm61mRNA在膀胱癌组织表达为（2.02±1.01），在癌旁正常组织表达为（1.00±0.00），两者相比差异具有统计学意义（p<0.05）。2.初发患者hTrm61mRNA表达水平为2.050±1.090，复发患者为1.954±0.856， P=0.833>0.05，差异无统计学意义；男性患者hTrm61mRNA表达水平为1.952±0.801，女性患者为2.250±1.105， P=0.570>0.05，差异无统计学意义；浸润性癌患者hTrm61mRNA表达水平为2.116±1.254，非浸润性癌患者为1.908±0.686， P=0.632>0.05；组织学分级之间F=0.436，P=0.653>0.05，各组之间无显著性统计学差异。3.尿液中m1A水平有随癌组织中hTrm61mRNA表达水平的升高而上升的趋势，对两变量做Pearson相关分析：mRNA水平r=0.644，p=0.000<0.05，尿液中m1A水平与癌组织中hTrm61mRNA表达水平之间有正相关关系。4.用荧光定量PCR技术在人类膀胱尿路皮癌细胞株T24、5637、EJ及人类胚肾细胞株HEK-293中检测hTrm61的表达，各组之间表达差异具有显著的统计学意义(F=58.081P=0.000)。与HEK293（1.00±0.00）细胞株相比，5637细胞株hTrm61的表达为5.46±1.38，T24为1.03±0.24，EJ为1.17±0.19。进行LSD两两比较：5637与T24相比p=0.000，差异具有统计学意义；5637与EJ相比p=0.000，差异具有统计学意义；5637与HEK-293相比p=0.000，差异具有统计学意义。T24与HEK293相比p=0.937，差异无统计学意义； EJ与HEK293相比p=0.679，差异无统计学意义。5.在人类膀胱癌细胞株5637中敲低hTrm61，设置空白对照(BLANK)、阴性对照组(NC)及siRNA1、siRNA2(siRNA1和siRNA2均为敲除组)组。转染24h后提取总RNA检测敲低效果。空白对照（1.00±0.00）、阴性对照（0.96±0.09）、siRNA1(0.30±0.01)、siRNA2(0.48±0.01)之间F=120.559，P=0.000。进一步进行两两比较敲除组与空白对照及阴性对照组相比，hTrm61mRNA明显降低，其中siRNA1组的敲除效率能达到70%以上，效果最好。选用siRNA1进行后续实验。6.在5637细胞株中敲低hTrm61，用Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测细胞增殖活性，结果显示细胞增殖活性受到了明显的影响。敲除目的基因24小时后BLANK组、NC组和敲除组(sihTrm61)的OD值分别为0.87±0.03、0.81±0.02和0.72±0.09，各组间差异具有统计学意义。敲除hTrm6148小时后，sihTrm61组、BLANK组和NC组的OD值分别为1.03±0.09，0.95±0.06和0.83±0.02，各组之间差异具有统计学意义；敲除hTrm6172小时后，sihTrm61组、BLANK组和NC组的OD值分别为1.04±0.04，0.99±0.03和0.92±0.04，各组之间差异具有统计学意义。7.在5637细胞株中敲低hTrm61，48h后按照细胞凋亡检测试剂盒的步骤收集细胞，运用流式细胞术进行检测，BLANK组凋亡细胞占百分比6.06±0.67，NC组凋亡细胞占百分比6.01±1.41，sihTrm61A组凋亡细胞百分比占9.81±0.14。各组间差异具有统计学意义（F=11.490, p=0.039）。行LSD两两比较：BLANK与NC间p=0.96，差异无统计学意义；BLANK与sihTrm61A间p=0.026，差异具有统计学意义；NC与sihTrm61间p=0.025，差异具有统计学意义。【结论】1.同一患者癌组织中hTrm61mRNA的表达水平明显高于癌旁组织，且尿液中m1A水平与癌组织中hTrm61mRNA的表达水平呈正相关关系，提示hTrm61mRNA表达增高是引起尿液中m1A水平升高的原因之一。2. hTrm61mRNA在膀胱癌组织中的表达水平与临床病理特征之间无明显相关关系。3.膀胱癌细胞株5637中敲除hTrm61基因，结果发现膀胱癌5637细胞株的增殖及凋亡均受到了明显影响，提示hTrm61在膀胱癌发生机制中起到了重要作用，hTrm61可能参与并促进了膀胱癌的发生过程，同时也强烈提示hTrm6p/hTrm61p是治疗膀胱癌的潜在靶点。