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B7-CD28途径作为经典的协同刺激途径，已受到广泛深入的研究。最近B7超家族新成员PD-L1(Ligand 1 of programmed death-1)的发现，为协同刺激途径开辟了新思路。PD-L1被证实是PD-1的受体，通过与CD28家族新成员PD-1的IgV样结构域相互结合，将所产生的信号传至PD-1胞浆区尾部的ITIM基序(免疫受体酪氨酸抑制基序)，在免疫应答中，对T、B淋巴细胞及非淋巴组织发挥重要的负性调控作用。最近有文献证明PD-L1存在第二受体，在机体的免疫应答中发挥正性调节作用。有研究证明该途径在自身免疫病或肿瘤免疫中发挥重要作用，因此可通过制备特异性抗PD-L1单抗或其可溶性抑制因子，对该途径进行阻断，以增强CTL杀伤癌细胞的功能；或者将编码PD-L1基因的重组病毒载体，设计抗原特异性病毒载体疫苗，对自身免疫病或肿瘤进行免疫干预性治疗。本研究旨在通过PD-L1转基因细胞的构建和其单抗的研制，进一步探讨PD-L1信号发挥作用的分子机制及与之相关自身免疫病、肿瘤发生的关系。 第一部分——PD-L1转基因细胞的构建。利用PCR的方法从人心cDNA文库中扩增出PD-L1基因并构建含PD-L1基因的重组逆转录病毒载体，最终转染L929细胞，成功构建了稳定高表达PD-L1分子的细胞株PD-L1／L929。 第二部分——探讨PD-L1信号在PHA体外激发体系中对人外周血T细胞的协同调节作用。采用10μg／ml PHA刺激人外周血T细胞体外培养体系，加入转基因细胞PD-L1／L929混合培养；免疫荧光标记和流式细胞仪分析T细胞表型及细胞周期；~3H-TdR掺入法观察T细胞的增殖；ELISA法检测T细胞对IL-2和IFN-γ的产生。结果表明PD-L1转基因细胞在PHA激发T细胞增殖的培养体系中，具有显著下调T细胞活化表型，抑制T细胞对PHA促增殖的反应性，这种抑制效应与其阻断T细胞PD一Ll转基因细胞的构建及功能性鼠抗人PD一Ll单抗研究中文摘要于GO/GI细胞周期及使活化T细胞分泌IL一2和IFN一Y的水平下降有关。同时还首次发现PD一L1信号能抑制PHA介导的T细胞活化诱导凋亡。 第三部—分鼠抗人PD一1单抗的研制。利用高表达人PD一L1分子的PD一L1几929细胞为免疫原按照常规方案免疫6一8周龄Balb/C小鼠。激发免疫后，将小鼠的脾脏细胞与小鼠SPZ/0在PEG下融合，杂交瘤细胞在H八T选择培养基下培养14天左右。先后使用PD一Ll几929和VK-L929细胞为筛选细胞，采用间接免疫荧光试验法经流式细胞仪检测杂交瘤的培养上清中抗PD一Ll抗体的分泌情况。阳性克隆经有限稀释法多次亚克隆直至所有培养孔中的杂交瘤上清皆为阳性。实验先后共融合40块%孔板，筛选后有1孔为分泌抗体阳性孔，复测后获取1株持续分泌特异抗体的杂交瘤株(ZHll)，为lgGI，K。腹水型单抗ZHll的效价分别为1: 2000。经纯化后抗体ZHll的蛋白含量平均为2.73m留d腹水。Westem一blotting分析显示，两株抗体都可以特异性识别PD一Ll几929细胞上的大约3OKD大小的蛋白质，而不能识别VK一L929。抗原位点竞争抑制实验提示ZHll单抗可以部分抑制商品化的mAbanti一PD一L1一PE与PD一LI/L 929细胞上抗原位点的结合。采用流式细胞术和免疫组化，通过测定抗体ZHll与不同细胞和细胞株以及组织的结合，检测了PD一Ll分子的表达谱。结果表明该单抗可以进行细胞表面分子的检测和免疫组化的标记，并且PD一L1分子在许多肿瘤细胞表面均有不同程度的表达。 第四部分一ZHn单抗对PD一Ll信号在T细胞增殖和DC发育成熟中的生物学作用的研究。3H一TdR结果提示，单抗ZHn的刺激能够促进anti一cD3活化的T细胞的增殖，且该效应是剂量依赖性的。同时对各组T细胞的表型进行检测，结果提示单抗ZHll具有促进T细胞活化的作用;ELISA法检测结果提示单抗2Hll的刺激可以显著上调T细胞IL一10的分泌量，但对IL一2和IFN一下的分泌影响甚微(仅有微弱的下调)，且单抗ZHll的功能是通过逆向信号的作用来发挥的。同时在未成熟DC中加入ZHll单抗后，同样通过逆向信号的传递导致DC成熟滞后和DC表面协同刺激分子表达的改变，进而影响DC的功能。PD一Ll转基因细胞的构建及功能性鼠抗人PD一L1单抗研究中文摘要 综上所述，本研究成功构建了稳定高表达PD一Ll分子的转基因细胞株PD一Ll几929，并首次发现PD一Ll信号能抑制PHA介导的T细胞活化诱导凋亡。同时还成功研制出能稳定分泌特异性功能型鼠抗人PD一Ll单克隆抗体，该单抗能通过逆向信号，诱导T细胞的增殖和IL一10的分泌，并且能抑制不成熟DC的发育成熟和一些协同刺激分子的表达。本研究所取得的创新性成果，为深入开展PD一Ll分子发挥作用的信号途径、与免疫疾病的关系、可溶性PD一L1检测试剂盒的研制以及人源化PD一Ll单抗的临床应用开发提供了理论依据和实验基础。