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[背景与目的]中枢神经系统的发育是一个复杂而又精密的过程,各种基因在目前尚不完全清楚的机制诱导下按照一定的时序表达,它们的产物又有序地调控神经细胞的迁移、增殖、生长、分化与消亡。大脑皮质细胞的产生按照自内向外的原则,神经元定位在大脑皮质的哪一层,受到内源性和外源性信号调节,主导作用的是内源性信号。
RAGs的编码产物RAG-1和RAG-2的复合物能特异性识别Ig胚系基因中V、DH、J基因片段两侧的重组信号序列,切断DNA双链,引发V(D)J基因片段重排。RAGs是在淋巴细胞发育过程中产生抗体多样性的基础。哺乳动物中枢神经系统也可能存在位点特异性的重组。
本研究通过免疫组织化学和RT-PCR,旨在观察RAG-1在小鼠脑组织正常发育期间出现的表达变化,并对其进行组织定位,以探讨它在中枢发育过程所起到的作用,并为下一步科研工作提供理论依据。
[方法]取E11(胚胎11天)、E13、E15、E17、E19、新生的和成年的ICR品系小鼠脑组织,抽提脑组织总RNA进行RT-PCR,RT-PCR产物用凝胶成像观察。引物:RAG-1widetype:sense:5ACTCAATTCTGACTCAACG3Antisense:5AACAGATGTCACAGGACG3。脑组织经多聚甲醛固定,冠状切面,隔四取一,制作连续冰冻切片,行酶标免疫组织化学和尼氏染色。免疫组化结果用显微镜成像并做灰度统计分析。
[结果]在E11的组织切片上可见RAG-1免疫阳性细胞首先出现于室管膜层;到E13在杏仁核区和下丘脑区免疫阳性的神经纤维表达,室管膜层和中间层中免疫阳性的神经元以幼稚的神经元为主,突起较少E15时,室管膜层表达变少,皮质板层RAG-1免疫阳性细胞大量表达,丘脑、下丘脑和杏仁核仍以阳性神经纤维多见;其后E17,随着大脑皮质的逐渐增厚,室管膜下层和皮质板层中的神经细胞及各层间走行的神经纤维均可出现RAG-1表达;E19表达类似E17,但室管膜层和室管膜下层表达较少,皮质板层增厚;新生鼠表达主要位于皮质板层和海马区域,免疫阳性的神经元形态上跟成年的基本一致;成年鼠脑表达主要位于海马、小脑颗粒细胞,偶见于颞叶和额叶的皮质。
灰度统计结果表明:RAG-1在小鼠胚胎脑组织中自胚胎11天开始出现表达,到19天到达高峰,新生鼠表达略有下降,但表达水平仍高于成年对照组。RT-PCR的结果显示跟免疫组化灰度统计结果基本一致,表达高峰出现在胚胎17天。
[结论]RAG-1在小鼠胚胎脑组织中表达,并且跟脑神经元的发育时序性吻合;RAG-1在胚胎脑组织中的表达量高于成年鼠脑内表达。