隐球菌病是由隐球菌引起的侵袭性真菌病，分布于全球，病死率高，治疗充满挑战。在过去的20年中，隐球菌病发病率呈上升趋势，尤其在中国[1,2]。全世界每年新发的隐球菌脑膜炎病例约有100000例，即使接受两性霉素B抗真菌治疗，隐球菌性脑膜脑炎急性期（3个月内）的死亡率仍高达35~40％［3］。在全球范围内，新生隐球菌大多数感染免疫低下人群，以艾滋病病毒（HIV）感染者最为多见。而在中国，新生隐球菌绝大多数感染的是非HIV的所谓“免疫正常”患者，且治疗抵抗。隐球菌有很强的嗜中枢性，隐球菌在感染中枢神经系统的过程中，通过血脑屏障后隐球菌的病理生理学改变尚无透彻的研究。小胶质细胞是中枢神经系统的常驻吞噬细胞，与血管周围及脑膜巨噬细胞共同组成了脑组织抵抗感染的第一道防线。在静息状态下，小胶质细胞监视着中枢神经系统，而在病原体人侵等微环境发生改变时，小胶质细胞迅速活化。MicroRNA(miRNA)能抑制靶基因表达，影响炎症反应，调节小胶质细胞的功能。因此，设想miRNA靶向调控基因，影响小胶质细胞在新生隐球菌的清除和神经炎症反应。本课题将深人研究隐球菌颅内感染的发病机制，寻求该病更为明确的发病机制和有效防治方法。　　第一部分 新生隐球菌诱导小胶质细胞系BV2后miRNA-30c-5p,eIF2α及炎症因子的表达　　用新生隐球菌标准株WM148干预BV2小胶质细胞，分别在0，3，6，9，12小时用qRT-PCR检测miR-30c的表达水平，CCK8试剂盒检测BV2细胞活性和流式细胞学进行凋亡分析，炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表达水平，miR-30家族的表达情况。　　结果发现：1）WN148诱导BV2细胞后miR-30c-5p,miR-15b-5p,miR-155-5p的表达规律，发现仅miR-30c-5p的表达随时间下降。2）WN148诱导后BV2细胞随时间细胞活性降低，细胞数减少。3）WN148诱导BV2细胞后炎症因子IL-6和TNF-α表达增加。4）miR-30家族中除miR-30c外，其余表达紊乱均无统计学意义。5）WN148诱导后BV2细胞的凋亡分析，BV2细胞活性降低可能与存在凋亡现象有关。　　以上结果表明miR-30c-5p在隐球菌感染BV2细胞中的免疫反应起着调节作用，但具体功能和机制仍不清楚，有待下一步研究。　　第二部分 过表达miRNA-30c-5p能抑制炎症因子的表达，促进BV2细胞存活　　为研究miR-30c-5p对炎症反应的调控机制，首先建立了新生隐球菌诱导的细胞模型，转染miR-30c-5p的mimic和inhibitor后0，6小时，发现过表达或抑制miR-30c-5p可调控炎症因子IL-6和TNF-α的表达。同时用流式细胞学检测BV2细胞的凋亡情况。　　结果表明过表达miRNA-30c-5p能抑制炎症因子的表达，促进BV2细胞存活：1）过表达或抑制miR-30c-5p可调控炎症因子IL-6和TNF-α的表达。2）过表达miR-30c-5p能抑制细胞凋亡，miR-30c-5p对BV2细胞起保护作用。这些结果意味着mir-30c-5p在宿主抵御隐球菌感染的过程中起着保护性的作用。然而，miR-30c-5p通过何种通路和靶基因发挥调节炎症反应作用尚不清楚，故下一步将深人进行机制研究。　　第三部分 miRNA-30c-5p靶向eIF2α基因在eIF2α/ATF4通路的调节作用　　通过TargetScan数据库对miR-30c-5p的靶基因进行了富聚分析和功能预测，井结合文献报道选取eIF2α的mRNA作为miR-30c-5p的靶基因进行下一步研究对象。进一步用荧光酶报告系统验证了miR-30c-5p与eIF2α的靶向关系。证实eIF2α为miR-30c-5p的靶基因。此外，为探究miR-30c-5p下游基因eIF2α对炎症反应的调控作用，转染eIF2αsiRNA，设置0、6小时两个时间点，结果表明eIF2α可调控炎症反应，主要影响IL-6和TNF-α的水平，同时抑制eIF2α后凋亡细胞显著减少。结合文献发现miR-30c-5p靶向eIF2α抑制eIF2α/ATF4通路及下游凋亡相关蛋白，为进一步证实该机制，转染miR-30c-5p的mimic和inhibitor后0，6小时，结果显示miR-30c-5p靶向eIF2α，能抑制eIF2α在蛋白水平的表达，亦能抑制eIF2α/ATF4通路及下游CHOP、Bim、BCL2凋亡相关蛋白的表达。BV2细胞感染新生隐球菌后细胞活性降低，凋亡增多可能是通过eIF2α/ATF4通路及下游的凋亡相关蛋白起作用。　　以上结果表明，miR-30c-5p能靶向eIF2α进而抑制ATF4通路，减少BV2细胞凋亡，提示miR-30c-5p在隐球菌感染脑组织中能抑制BV2细胞凋亡，促进存活。　　第四部分 新生隐球菌诱导小胶质细胞系BV2后存在自噬现象　　团队的前期研究发现，在新生隐球菌干预后,自噬在调节巨噬细胞的炎性反应上发挥着重要作用。自噬在新生隐球菌感染时持续存在,自噬的存在可以一定程度抑制巨噬细胞的凋亡,对维持细胞稳定起着一定的作用。因此，在本研究中，eIF2α/ATF4通路是如何介导炎症因子的表达，其中一个可能的解释就是自噬现象。另外，自噬是否影响了BV2细胞的凋亡。进行了自噬相关的研究。　　结果发现新生隐球菌干预BV2细胞后可观察到自噬现象，自噬小体和自噬溶酶体增加。自噬现象可能参与到eIF2α/ATF4通路，调节隐脑感染的炎症反应，影响BV2细胞的活性。自噬减少隐球菌负荷，减少宿主细胞凋亡。本研究中，BV2细胞的活性变化可能是受到自噬机制和凋亡机制的共同作用影响。　　第五部分 人隐球菌性脑膜炎临床样本中miRNA-30c-5p,eIF2α的表达　　为更进一步深人研究，除上述细胞实验外，本课题还进行了临床研究。这部分研究采用隐球菌诊疗指南明确诊断为隐球菌性脑膜炎的患者，设置治疗前组，检测脑脊液中隐球菌计数及乳胶凝集试验。在这些患者有效抗真菌治疗后，脑脊液中隐球菌计数及乳胶凝集试验呈显著下降，设置为治疗后组。结果显示，有效抗真菌后脑脊液中miR-30c-5p表达增加，eIF2α表达减少。由于外周血是更易获得且便于疗效随访的标本，因此本实验亦关注miR-30c-5p在血清中的表达水平，结果显示设置健康对照组、治疗前组和治疗后组，隐球菌性脑膜炎患者治疗前的血清miR-30c-5p呈低水平，在有效治疗后，miR-30c-5p水平显著升高。结果提示血清与脑脊液中的miR-30c-5p的表达规律一致，与上述细胞学实验的结果相符。　　综上所述，本研究对microRNAs在新生隐球菌感染小胶质细胞中调节作用提供了新的思路。发现在新生隐球菌感染BV2小胶质细胞后miR-30c-5p下调。miR-30c-5p靶向eIF2α,抑制eIF2α/ATF4通路，抑制炎症反应，减少BV2细胞的凋亡，促进存活。此外，本研究观察到新生隐球菌干预BV2细胞后存在自噬现象，自噬可能参与到eIF2α/ATF4通路，调节炎症反应，影响BV2细胞的活性。新生隐球菌感染后的炎症反应和宿主细胞的结局可能是由自噬机制和凋亡机制的共同作用所致。最后，在隐球菌性脑膜炎患者的临床样本中发现，miR-30c-5p表达增加，eIF2α表达减少，与体外实验一致。基于我们的研究结果，miR-30c-5p或许可作为新的生物学标志，帮助隐球菌性脑膜炎的诊断和病情监测。特殊的miR-30c-5p的增强剂也许可作为潜在的治疗靶点。