猪圆环病毒病（PCVD）是由猪圆环病毒（PCVs）引起的一系列猪传染性疾病的统称,包括猪繁殖障碍综合症（SMEDI）、断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）、皮炎肾病综合症（PNDS）、仔猪先天性震颤（CT）、猪呼吸道综合症（PRDS）和肠炎。猪圆环病毒2型（PCV2）作为猪圆环病毒病的主要病原,该病毒的传播给养猪业造成了重大经济损失。PCV2的快速检测对于该病的净化具有重要的意义,目前大多数PCV2的检测方法具有较高的灵敏性和良好的特异性,但这些方法往往需要复杂的操作步骤和繁琐的样品处理过程,同时也依赖于特定的实验仪器以及专业的操作人员。因此,目前的检测方法无法满足现场对PCV2快速准确地检测。所以,建立一种操作简单、对人员和设备要求低、可以实地进行检测、反应快速灵敏且特异性良好的检测方法对于PCV2的防控具有重要价值。CRISPR/Cas系统的研究为病原的现场快速检测提供了一种新思路,该系统是几乎所有的细菌实现获得性免疫的方式,其中的CRISPR/Cas12a系统可以在识别靶标序列后切割靶序列并具有对非特异性ss DNA的切割活性,利用CRISPR/Cas12a系统的这种特性,在检测体系中加入ss DNA报告分子可以实现对病原的可视化检测。RAA（重组酶介导等温核酸扩增技术）是一种利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶在恒温条件（如37°C）下扩增DNA的方法,在实地进行检测具有优势,不需要大型仪器且操作简单。目前,已将等温扩增技术与CRISPR/Cas系统相结合用于检测PCV3、ASFV、PRRSV等,但还没有用于对PCV2的检测。本研究通过将RAA与CRISPR/Cas12a系统相结合,用RAA进行PCV2核酸的扩增后再进行CRISPR/Cas12a的检测,检测结果可以通过蓝光照射或试纸条来判读,该方法可以在脱离大型仪器的情况下现场完成对PCV2的快速核酸检测。研究结果如下:（1）成功表达纯化了As Cas12蛋白,并证明了其具有切割活性。在IPTG浓度为0.5 m M,温度为30°C,180 r/min的诱导条件下诱导2.5 h后成功诱导出所需蛋白,并通过Ni-NTA树脂和MBP标签纯化柱纯化出了As Cas12a蛋白。经过检测试验证明了其具有切割活性。（2）成功设计出针对PCV2并适用于As Cas12a的g RNA。在分析筛选了PCV2的保守序列后,根据As Cas12a所识别的PAM序列找到了Protospacer序列并设计了g RNA,检测结果证明设计的g RNA满足检测条件。（3）成功设计出针对PCV2检测靶序列的RAA引物。根据RAA引物设计原则,针对检测的PCV2靶序列设计了4对引物,通过等温扩增以及显色试验筛选出最佳的1对引物,该引物可以扩增出PCV2的检测靶序列用于检测且扩增效率高。（4）成功建立了基于RAA-CRISPR/Cas12a检测PCV2的方法并进行了反应体系的优化。研究中比较了一管反应与两管反应的优劣,结果显示一管反应速度快且操作简单;用不同浓度的蛋白和不同浓度的g RNA做正交实验选择体系中最适的蛋白和g RNA的浓度,结果显示体系中最佳的As Cas12a蛋白和g RNA的浓度分别为100 n M和200 n M;通过反应中各个时间段的荧光信号值或不同反应时间试纸条的检测结果,确定了该方法中荧光检测和试纸条检测都可以在30 min以内得到准确检测结果。（5）检验并证明了所建立的检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性。将PCV2与PCV3、PRV、PRRSV、CSFV、ASFV的阳性质粒通过该检测方法检测后只有PCV2的检测结果显示为阳性,表明该检测方法特异性良好;检测1010～10~0copies/μL的含有检测靶序列的PCR产物,结果显示该检测方法可检测PCV2的下限为10 copies/μL,比PCR检测PCV2方法的灵敏性高1000倍;多批次检验不同拷贝数阳性样品后,批内变异系数小于5%,批间变异系数小于10%,证明该检测方法具有良好的重复性。（6）检验并证明了所建立的检测方法可以用于临床上对PCV2的检测。利用该检测方法对采集的病理样品进行PCV2检测,得到的检测结果与PCR检测PCV2的结果进行比较。52份样品中,用该方法检测结果为14例阳性和38例阴性,用PCR方法检测结果为13例阳性和39例阴性,一致性为98%,表明该方法满足临床检测PCV2的条件。综上所述,本研究建立了一种基于RAA-CRISPR/Cas12a核酸检测PCV2的方法,可以在无需大型仪器的恒温条件（37°C）下对PCV2进行检测,该方法特异性好、灵敏性高、操作简单、要求较低、耗时短,为PCV2的检测提供了一种新的技术手段。