论文部分内容阅读
背景:急性冠脉综合征的发病率逐年上升,现已成为世界人口的主要死亡原因。冠状动脉粥样硬化斑块的形成,破裂,随之引发血栓可使管腔不完全或完全阻塞,从而引发急性心血管事件的发生。了解其的病理机制,寻找简单而有效的检测、治疗手段从而减少斑块形成或增加斑块的稳定性,具有重要的临床意义及价值。目的:蛋白质棕榈酰化修饰是唯一可逆的翻译后脂质修饰形式,能增加可溶性蛋白与膜的亲和性,对蛋白质的转运、定位和功能具有重要的作用。酰基蛋白硫酯酶1（acyl protein thioesterase 1,APT1,Lypla1）是去棕榈酰化修饰蛋白,可以参与多种蛋白的棕榈酰修饰。有文献报导其的抑制剂可以通过作用H-Ras的去棕榈化修饰,影响H-Ras定位,从而影响下游的信号通路并逆转H-Ras引起的肿瘤表型改变。但是,有关Lypla1对Ras功能影响的研究在心血管系统至今少有报道。本研究通过ox-LDL刺激人脐静脉内皮细胞及高脂喂养apoE-/-小鼠建立动脉粥样硬化模型,以Lypla1因子为核心,一方面确定其上游调控因子miR-138,另一方面通过对Lypla1下游H-Ras棕榈化修饰和MAPK信号通路的影响进行研究,力求阐明Lypla1棕榈酰化修饰在动脉粥样硬化发生发展中的作用机制和上下游通路,为该病的诊断提供新的标志物并为精准治疗提供新的可靠靶点。方法:利用生物信息学,qRT-PCR和双荧光报告载体实验方法验证Lypla1与上游作用因子miR-138直接靶定关系,及miR-138与上游调控因子H19直接靶定关系。随后,在动脉粥样硬化的细胞模型中,通过qRT-PCR和Western blot检测ox-LDL不同时间点刺激对H19、miR-138、Lypla1、DHHC9和Ras表达的影响;而后过表达或抑制表达Lypla1后检测对下游基因H-Ras表达和定位的影响,并通过抑制表达Lypla1后检测对单核细胞粘附能力,内皮细胞脂质吞噬聚集能力及对下游炎症因子的影响;随后,通过LPC诱导HUVECs细胞,检测培养液上清微囊泡中miR-138和Lypla1的表达变化,并将微囊泡与THP-1巨噬细胞共培养观察对巨噬细胞MMP-9表达的影响;最后,高脂喂养apoE-/-小鼠建立动脉粥样硬化动物模型,验证H19,miR138及Lypla1在在体动物模型中的表达变化。结果:动脉粥样硬化细胞模型中Lypla1表达升高,而miR-138表达降低,（P<0.05）,且Lypla1蛋白表达出现由胞浆转入到胞膜现象。应用生物信息学,qRT-PCR,Western blot和双荧光报告载体实验验证了miR-138是Lypla1的上游作用因子,可以抑制Lypla1的表达,同样也验证了H19是miR-138的上游作用因子。抑制表达Lypla1后H-Ras胞膜表达降低,p-MEK和p-ERK表达降低,炎症因子MMP-9、ICAM-1和VCAM-1基因表达减少（P<0.05）,巨噬细胞粘附能力减弱（P<0.05）,dil-ox-LDL吞噬沉积能力增加（P<0.05）。随后我们用LPC刺激HUVECs后通过超速离心搜集微囊泡,检测Lypla1的RNA和蛋白水平,发现刺激24h后Lypla1表达明显增加（P<0.05）,且将微囊泡与巨噬细胞共培养后,发现巨噬细胞的MMP-9表达增加（P<0.05）。最后,在动物模型中发现高脂喂养组较正常喂养组H19,Lypla表达明显增多（P<0.05）,miR-138表达减少（P<0.05）。结论:Lypla1一方面在内皮细胞内通过影响H-Ras棕榈酰化修饰及其下游MAPK通路,最终影响炎症因子的表达;另一方面其可以以微囊泡为载体离开内皮细胞,影响巨噬细胞的MMP-9表达,进一步参与动脉粥样硬化的形成与发展。