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目的:间变性淋巴瘤激酶络氨酸激酶抑制剂(anaplastic lymphoma kinase tyrosine kinase inhibitors,ALK-TKIs)的问世改变了棘皮动物微管相关蛋白样-间变性淋巴瘤激酶4(echinoderm microtubule-associated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK)融合基因阳性晚期非小细胞肺癌(advanced non-small cell lung cancer,NSCLC)患者的治疗策略,使此类患者得到了明显的生存获益,然而,耐药的发生是制约更大临床疗效的最主要障碍,旁路信号通路的激活是NSCLC靶向治疗的耐药机制之一。甲磺酸阿帕替尼作为多靶点的抗肿瘤药物,其能高效且特异性地与血管内皮生长因子-2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2,VEGFR-2)的ATP位点结合,使VEGFR-2无法被激活,阻断下游信号传导,表明其有潜在的提高治疗疗效及克服与血管生成相关的获得性耐药能力。本研究旨在探讨人胰岛素样生长因子1(human insulin-like growth factors 1,hIGF-1)以旁路信号激活的方式诱导EML4-ALK融合基因阳性肺癌细胞株H3122对alectinib的耐药,并进一步探讨抗血管生成药物甲磺酸阿帕替尼在alectinib耐药中的作用。方法:1.qRT-PCR检测H3122细胞株中IGF-1R的表达情况。2.采用CCK-8(cell counting kit-8)法检测H3122细胞株(含EML4-ALK融合基因变体1:(1)对阿帕替尼的敏感性检测;(2)对alectinib的敏感性检测(1)检测在不同浓度的alectinib处理下,H3122细胞的增殖情况;(2)hIGF-1诱导后H3122细胞对alectinib的敏感性的检测,应用不同浓度的hIGF-1(50、100、150 ng/mL)联合不同浓度的alectinib处理H3122细胞(H3122-IGF-CR),继续培养72 h后,检测在有hIGF-1存在的情况下,H3122细胞对alectinib敏感性变化;(3)在hIGF-1诱导耐药的情况下,联合10μmol/L阿帕替尼处理后,H3122细胞对药物的敏感性变化。通过GraphPad Prism 5软件计算药物的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)、H3122-IGF-CR细胞的耐药指数及阿帕替尼逆转耐药的逆转倍数。3.用PE Annexin V/7-AAD双染法检测细胞凋亡情况;根据CCK-8试验结果,以0.03μmol/L alectinib和10μmol/L阿帕替尼作为药物实验浓度,(1)检测H3122细胞在0.03μmol/L alectinib作用48h后的凋亡率;(2)检测100 ng/mL hIGF-1诱导后alectinib对H3122细胞的凋亡率;(3)联合10μmol/L阿帕替尼处理后,细胞凋亡率的变化情况。4.应用平板克隆形成实验及划痕试验检测hIGF-1及阿帕替尼对H3122细胞细胞增殖、迁移的影响。将细胞分为3组,空白对照组、100 ng/mL hIGF-1刺激组,联合治疗组加入100 ng/mL hIGF-1刺激及10 umol/L阿帕替尼处理。5.应用蛋白质免疫印迹技术(Western blot)检测alectinib单独作用或联合阿帕替尼在hIGF-1(100 ng/mL)处理后H3122细胞中下游信号通路PI3K/AKT,Ras-Raf-MEK-ERK/MAPK,JAK3/STAT3及血管生成相关信号通路HIF-VEGF-VEGFR的变化情况,深入探究耐药及逆转耐药的分子机制。结果:1.qRT-PCR结果显示IGF-1R基因在H3122细胞中ct值为(20.90±0.06),内参ct值(12.48±0.12),ΔCt值<12,P<0.05,提示IGF-1R在H3122细胞株中高表达;2.ALK阳性肺癌细胞株H3122对较高浓度阿帕替尼敏感,在浓度低于10 umol/L时对H3122细胞增殖无抑制能力,IC50为42.97 umol/L;3.ALK阳性肺癌细胞株H3122对alectinib高度敏感,呈显著的浓度依赖性,其IC50值为(0.01737±0.17)umol/L;在100 ng/mL hIGF-1因子刺激下,H3122细胞对alectinib敏感性降低,IC50为(0.2618±0.30)umol/L,耐药倍数为15.07倍。选择对细胞无毒性作用的阿帕替尼浓度(10μmol/L)联合处理细胞后,细胞对alectinib处理再次敏感,IC50为(0.0905±0.07)umol/L,逆转倍数为6.5倍。4.Alectinib对H3122细胞有促凋亡作用,而在hIGF-1的诱导作用下其凋亡率降低。0.03 umol/L alectinib单药处理48h后H3122细胞的凋亡率为(19.77±0.93)%,而alectinib联合100 ng/mL hIGF-1刺激48h后,凋亡率明显降低,为(8.35±0.37)%,显著低于Alectinib单药组(P<0.05);联合10μmol/L阿帕替尼处理后,细胞凋亡率增加,为(14.5667±0.56)%,与alectinib联合hIGF-1组对比具有统计学差异。5.划痕试验克隆形成试验结果表明,与空白组相比,hIGF-1组细胞的迁移能力及增殖能力增强,然而,在加入阿帕替尼处理后,细胞的迁移能力及增殖能力明显受抑制(P<0.05)。hIGF-1刺激组与阿帕替尼联合hIGF-1刺激组的细胞划痕间伤口愈合距离百分比分别为(80.79±1.28)%和(56.18±0.96)%;克隆形成率分别为(31.5%±1.04)%和(16.5±0.17)%,P<0.05。这些数据表明,阿帕替尼可以削弱由hIGF-1刺激引起的迁移和增殖能力。6.0.03 umol/L alectinib作用H3122细胞4 h后可抑制p-AKT、p-ERK和p-STAT3磷酸化蛋白的表达,通过100 ng/mL IGF-1的刺激,IGF-1R、AKT、mTOR、p70s6k、ERK、STAT3的磷酸化水平增加,而总蛋白表达量不变,除此之外,在100 ng/mL IGF-1的刺激后,HIF-1a、VEGFR2、p-VEGFR2的表达增加。联合使用10μmol/L阿帕替尼后,除能抑制血管内皮生长因子受体的表达外,下游被活化的磷酸化蛋白也不同程度地再次受到抑制。结论:hIGF-1通过激活IGF-1R旁路途径进而激活下游信号通路介导了H3122细胞对alectinib的继发耐药,与此同时,激活了血管生长相关信号通路,联合使用抗血管生成药物能有效逆转耐药,为临床遴选克服耐药策略提供参考。