目的与意义甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤,其发病率在全世界范围内呈逐年上升趋势。甲状腺滤泡癌（follicular thyroid carcinoma,FTC）是甲状腺癌的常见类型,并具有高侵袭性高转移性的特点,常常侵犯被膜及血管,伴有肺、骨骼、大脑和肝脏等器官的远处转移。目前尚无明确的分子靶标可以预测甲状腺滤泡癌的转移风险和评估预后,其病理形态学表现也难以指示其生物学行为。因此,深入研究促进甲状腺滤泡癌增殖、转移的分子机制对寻找反映肿瘤侵袭性的生物标志物、探索有效治疗靶点、改善其预后具有重要意义。蛋白质的糖基化修饰是一种重要且常见的蛋白质翻译后加工修饰类型,是在糖基转移酶（glycosyltransferase）的作用下将糖类物质共价结合于蛋白质多肽链形成糖苷键,在细胞识别、受体活化、信号传递等过程中发挥关键性调控作用。根据糖基化连接位点的不同,蛋白质糖基化可分为N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化及糖基磷脂酰肌醇锚定连接等。根据其催化底物的类型不同,糖基转移酶可分为岩藻糖基转移酶（fucosyltransferase,FUT）、葡萄糖基转移酶、N-乙酰葡萄糖基转移酶、N-乙酰半乳糖基转移酶等多种类型。FUT作为糖基转移酶家族中的一员,催化核苷二磷酸岩藻糖将岩藻糖基转移至糖复合物的糖链末端上,并以α-岩藻糖苷键相连接。到目前为止,人类基因组中已经鉴定13种岩藻糖基转移酶。根据岩藻糖基转移酶催化生成的糖苷键类型的不同,将其分为三大类:催化形成α1,2-糖苷键的岩藻糖基转移酶,包括FUT1 和 2;催化生成 αl,3-/1,4-糖苷键的 FUT3、4、5、6、7、9、10 和 11;催化生成α1,6-糖苷键的FUT8。此外,还有两种催化合成O-岩藻糖苷键的岩藻糖基转移酶包括蛋白O-岩藻糖基转移酶1和2（POFUT1和2）。岩藻糖基转移酶及岩藻糖基化修饰的蛋白已经被证明参与了多种生理及病理过程,包括淋巴细胞归巢、精子卵子结合、肿瘤进展等。岩藻糖基转移酶VII（FUT7）是α1,3-岩藻糖基转移酶家族成员之一,催化合成α1,3-岩藻糖及唾液酸化路易斯X（sLeX）寡糖。据文献报道,FUT7在肝细胞癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤组织中高表达,与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）及预后不良密切相关。但是,FUT7在甲状腺滤泡癌细胞增殖、迁移侵袭过程的作用及相关分子机制尚不明确。细胞周期调控异常是导致肿瘤失控生长的主要机制。细胞周期蛋白CyclinD 1、CyclinE1及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21CIP1异常表达与细胞异常增生和肿瘤发生、发展密切相关。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）是一组具有高度同源性的锌依赖内肽酶,能降解细胞外基质及基膜,与肿瘤的侵袭、转移相关,是反映肿瘤侵袭性的重要指标。EMT是导致恶性肿瘤侵袭、转移的重要步骤,EMT发生过程中上皮表型标志物E-cadherin等逐渐丧失,而间质表型标志物N-cadherin、Vimentin等的表达上调。目前,FUT7对甲状腺滤泡癌细胞的增殖、EMT及迁移侵袭等影响的研究鲜有报道。表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）受体（EGF receptor,EGFR）是一种酪氨酸激酶受体,与EGF结合后发生构象变化,形成同质二聚体并发生自身磷酸化,启动下游信号级联效应,包括激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）以及磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B,PKB/Akt）途径等,进而影响肿瘤细胞生物学行为,包括增殖、迁移、凋亡等。糖基化修饰在调节EGFR受体结构及功能方面发挥关键作用,可影响受体在细胞表面的定位、配体结合、构象稳定性、二聚化及细胞信号转导等多个过程,从而调控肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭等行为。FUT7及其催化形成的α1,3-岩藻糖是否影响甲状腺滤泡癌细胞中EGF/EGFR信号通路值得探讨。本研究主要包括:1.对49例甲状腺滤泡癌病例及其中5例转移病例进行研究,分析FUT7在甲状腺滤泡癌组织中的表达特征及其与肿瘤生物学行为的相关性。2.利用人甲状腺滤泡癌低侵袭性细胞株FTC-133及高侵袭性细胞株FTC-238检测FUT家族在侵袭性不同的甲状腺滤泡癌细胞中的表达水平。研究FUT7对人甲状腺滤泡癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。3.研究FUT7对EGFR及其下游MAPK通路和PI3K-Akt通路的影响,探讨FUT7影响甲状腺滤泡癌细胞增殖、EMT和侵袭迁移的分子机制。本研究创新性地从蛋白质翻译后修饰的角度研究蛋白质糖基化对肿瘤发生、发展的影响。探索FUT7对侵袭性和转移性较高的甲状腺滤泡癌细胞增殖及迁移侵袭的调控作用。率先研究FUT7调控甲状腺滤泡癌细胞增殖和迁移侵袭的分子机制。以期为甲状腺滤泡癌的预后判断寻找生物标志物,为治疗甲状腺滤泡癌探索新的有效靶点,为改善甲状腺滤泡癌预后奠定基础。本研究主要分为以下三个部分:一、FUT7在人甲状腺滤泡癌组织中的表达研究实验方法:1.通过免疫组织化学检测49例甲状腺滤泡癌及癌旁甲状腺组织中FUT7的表达情况,分析FUT7的表达水平与甲状腺滤泡癌临床病理特征的相关性。2.采用免疫荧光和凝集素荧光染色方法分别检测甲状腺滤泡癌组织中sLeX寡糖和α1,3-岩藻糖的含量。3.选取年龄和性别配对的FUT7高表达及低表达病例各1 1例,通过免疫组织化学方法检测两组MMP-2的表达水平。4.采用免疫组织化学染色分析甲状腺滤泡癌转移病例的原发灶与转移灶FUT7、E-cadherin及Vimentin 的表达情况。结果:1.FUT7表达于甲状腺滤泡癌细胞胞质中。FUT7在甲状腺滤泡癌中的表达率及表达量均高于癌旁甲状腺组织。甲状腺滤泡癌组织中的FUT7表达量与肿瘤大小正性关联。2.与癌旁甲状腺组织相比,甲状腺滤泡癌组织中sLeX寡糖和α1,3-岩藻糖含量增高。3.FUT7高表达组甲状腺滤泡癌组织中的MMP-2表达增多,FUT7表达与MMP-2表达正性关联。4.与肿瘤原发灶相比,甲状腺滤泡癌转移灶中FUT7表达增高,E-cadherin表达减少,Vimentin表达增多。结论:1.FUT7在甲状腺滤泡癌中的表达增加且与肿瘤大小正性关联。2.甲状腺滤泡细胞癌中的sLeX寡糖及α1,3岩藻糖的含量增高。3.FUT7可能促进甲状腺滤泡癌细胞的迁移侵袭潜能。4.FUT7可能促进甲状腺滤泡癌细胞的上皮间质转化过程。二、FUT7对甲状腺滤泡癌细胞的增殖、迁移侵袭能力影响的研究实验方法:1.通过Real-time PCR方法检测低侵袭性甲状腺滤泡癌细胞FTC-133和高侵袭性滤泡癌细胞FTC-238中FUT家族成员的基因表达水平。2.通过Western blot及免疫细胞化学方法比较FTC-133细胞和FTC-238细胞中FUT7蛋白表达水平的差异。3.通过Real-time PCR及Western blot方法检测过表达FUT7或RNA干扰FUT7后人甲状腺滤泡癌细胞FTC-133、FTC-238中FUT7的表达量。4.通过Lectin blot及凝集素荧光染色的方法比较过表达FUT7及RNA干扰FUT7后人甲状腺滤泡癌细胞FTC-133、FTC-238中α1,3-岩藻糖的水平。5.通过Western blot及Real-time PCR方法检测过表达FUT7及RNA干扰FUT7后人FTC-133及FTC-238细胞的增殖相关核抗原（PCNA）、CyclinD1、CyclinE1以及P21CIP1蛋白的表达水平。6.通过CCK8实验和EdU实验分别检测过表达FUT7后的FTC-133细胞和RNA干扰FUT7的FTC-238细胞的增殖能力。7.采用Real-time PCR和Western-blot的方法,分别检测上皮间质转化标志物（E-cadherin、N-cadherin及Vimentin）在过表达FUT7的FTC-133细胞和RNA干扰FUT7的FTC-238细胞中的表达水平。8.采用Real-time PCR、Western-blot及明胶酶谱实验分别检测过表达FUT7的FTC-133细胞和RNA干扰FUT7的FTC-238细胞中MMP-2、MMP-9的表达水平。9.采用Transwell迁移侵袭实验和划痕实验检测过表达FUT7的FTC-133细胞和RNA干扰FUT7的FTC-238细胞的运动、迁移侵袭能力变化。结果:1.FUT7基因在高侵袭性甲状腺滤泡癌FTC-238细胞中的表达水平高于其他岩藻糖基转移酶。2.高侵袭性甲状腺滤泡癌FTC-238细胞中的FUT7mRNA及蛋白表达均高于低侵袭性甲状腺滤泡癌FTC-133细胞。3.与对照组相比,过表达FUT7的FTC-133细胞中FUT7mRNA及蛋白表达水平上调,合成的α1,3-岩藻糖增多;RNA干扰FUT7的FTC-238细胞中FUT7的mRNA及蛋白表达水平下降,所合成的α1,3岩藻糖含量减少。4.过表达 FUT7 后,FTC-133 细胞中 PCNA、CyclinD1 及 Cyclin E1 的 mRNA 及蛋白表达上调,而P21CIP1表达减少。下调FUT7表达后,FTC-23 8细胞中的PCNA、CyclinD1及CyclinE1的mRNA及蛋白表达下调,而P21CIP1表达增多。5.过表达FUT7促进FTC-133细胞增殖,下调FUT7表达抑制FTC-238细胞的增殖。6.过表达 FUT7 后,FTC-133 细胞的 E-cadherin 表达降低,N-cadherin 和 Vimentin表达增高;下调FUT7表达后,FTC-238细胞的E-cadherin表达上升,N-cadherin和Vimentin表达降低。7.过表达FUT7后,FTC-133细胞的MMP-2、MMP-9表达增加;下调FUT7表达后,FTC-238细胞的MMP-2、MMP-9表达降低。8.过表达FUT7后,FTC-133细胞的运动及迁移能力增强;下调FUT7表达后,FTC-238细胞的运动及迁移能力减弱。结论:1.高侵袭性甲状腺滤泡癌中的FUT7表达量高于低侵袭性甲状腺滤泡癌。2.FUT7促进甲状腺滤泡癌细胞的增殖、EMT及迁移侵袭。三、FUT7对甲状腺滤泡癌细胞表皮生长因子受体及其下游信号通路的影响实验方法:1.通过凝集素荧光染色方法检测过表达FUT7的FTC-133细胞和RNA干扰FUT7的FTC-238细胞EGFR的α1,3-岩藻糖化水平。2.通过免疫荧光方法检测过表达FUT7的FTC-133细胞和RNA干扰FUT7的FTC-238细胞中EGFR的表达及其磷酸化水平。3.通过Western blot方法检测过表达FUT7的FTC-133细胞和RNA干扰FUT7的FTC-238细胞的EGFR、磷酸化EGFR、Erk1/2、磷酸化Erk1/2、Akt及磷酸化Akt的蛋白表达水平。4.通过Western blot方法检测在无血清培养和EGF刺激情况下,过表达FUT7的FTC-133细胞和RNA干扰FUT7的FTC-238细胞中EGFR、磷酸化EGFR、Erk1/2、磷酸化Erk1/2、Akt及磷酸化Akt表达水平。5.利用不同浓度EGFR抑制剂（厄洛替尼）处理FTC-133和FTC-238细胞后,通过Western blot方法检测细胞中EGFR、磷酸化EGFR、Erk1/2、磷酸化Erk1/2、Akt、磷酸化Akt,以及PCNA、CyclinD1、Vimentin、N-cadherin及MM]P-2蛋白的表达水平。6,通过Western blot方法比较在EGF刺激情况下,过表达FUT7和RNA干扰FUT7及厄洛替尼对甲状腺滤泡癌细胞FTC-133和FTC-238中EGFR、磷酸化EGFR、Erk1/2、磷酸化 Erk1/2、Akt及磷酸化Akt,以及PCNA、CyclinD1、Vimentin、N-cadherin及MMP-2蛋白表达水平影响。结果:1.过表达FUT7的FTC-133细胞中α1,3-岩藻糖含量增加;下调FUT7表达的FTC-238细胞中α1,3-岩藻糖含量减少。2.过表达FUT7的FTC-133细胞中EGFR磷酸化水平升高;下调FUT7表达的FTC-238细胞中EGFR磷酸化水平下降。3.在过表达FUT7的FTC-133细胞中,EGFR、Erk1/2及Akt的磷酸化水平上调。在下调FUT7表达的FTC-238细胞中,EGFR、Erk1/2和Akt的磷酸化水平下调。4.EGF刺激后,转染过表达FUT7质粒的FTC-133细胞中的磷酸化EGFR、磷酸化Erk1/2和磷酸化Akt水平进一步升高;下调FUT7表达的FTC-238细胞中磷酸化EGFR、磷酸化Erk1/2和磷酸化Akt水平下降。5.EGFR抑制剂降低FTC-133细胞和FTC-238细胞中EGFR、Erk1/2、Akt的磷酸化水平,及PCNA、CyclinD1、Vimentin、N-cadherin、MMP-2的蛋白表达水平。6.在FTC-133细胞中,FUT7过表达进一步促进EGF介导的EGFR、Erk1/2、Akt的磷酸化和活化,增加其下游分子PCNA、CyclinD1、Vimentin,N-cadherin和MMP-2的表达;在FTC-238细胞中,下调FUT7表达抑制EGF介导的EGFR、Erk1/2、Akt的磷酸化和活化,减少其下游分子PCNA、CyclinD1、Vimentin,N-cadherin 和 MMP-2 的表达。结论:1.FUT7提高甲状腺滤泡癌细胞中EGFR的α1,3-岩藻糖基化和磷酸化水平。2.FUT7提高甲状腺滤泡癌细胞中ERK1/2和Akt的磷酸化水平,促进EGFR下游MAPK和PI3K/Akt信号通路的活化。3.FUT7 增加甲状腺滤泡癌细胞中 PCNA、CyclinD1、Vimetnin,N-cadherin 和MMP-2蛋白的表达水平,提示FUT7通过EGFR信号通路影响细胞内信号转导途径及其下游调控肿瘤细胞增殖、转移相关分子的表达。