三聚氰胺(melamine)是一种化工原料,为含氮杂环化合物,因其含氮量比较高,在2008年被不法分子掺入牛奶或奶粉中,给人们尤其是婴幼儿带来极大的损伤。四膜虫(Tetrahymena)是纤毛类原生动物,也是一种单细胞真核生物,因其以自由游泳方式生活在淡水环境中,所以对污染物胁迫响应更敏感、更直接;且生活周期短(2~2.5 h)、易于培养,因此它一直被作为毒理学研究的良好模式生物。本文采用镜下计数的方法观察了三聚氰胺对细胞增殖和四膜虫交配率的影响;用彗星电泳技术及DAPI细胞核染色观察了基因组的变化;采用流式细胞技术观察了细胞的凋亡情况;进而通过荧光定量PCR技术分析了不同浓度三聚氰胺胁迫下金属硫蛋白基因的表达变化。以期通过了解三聚氰胺对单细胞生物四膜虫的影响,进而深入了解三聚氰胺毒性作用机理,具体研究结果如下:1.三聚氰胺对单细胞生物四膜虫的毒性作用。本研究用含0、1、2、3、4 g/L三聚氰胺的培养基对四膜虫进行生长实验和交配实验。生长实验结果显示,四膜虫的计数结果随着培养液中三聚氰胺浓度的增高而降低,计算得到IC50为1g/L。交配实验结果显示,与对照组相比,低浓度(1、2 g/L)三聚氰胺可以促进四膜虫的交配,其在三聚氰胺浓度为2 g/L时达到峰值,交配数最高;其后随着三聚氰胺浓度的增高,交配数下降,表明高浓度(3、4 g/L)三聚氰胺抑制四膜虫交配。2.三聚氰胺对四膜虫基因组的影响和凋亡作用。本研究利用不同浓度的三聚氰胺(0g/L,1g/L,2 g/L,4 g/L)处理四膜虫细胞后,采用彗星电泳技术观察了DNA的损伤情况,结果发现只有最高浓度(4 g/L)三聚氰胺才能对四膜虫基因组产生明显的损害;处理后的细胞经流式细胞仪检测凋亡情况,发现在2 g/L和4 g/L的三聚氰胺浓度中细胞出现了明显的凋亡。这些结果说明三聚氰胺对DNA有损伤作用。3.三聚氰胺对四膜虫金属硫蛋白MTT1表达的影响。金属硫蛋白对基因组有保护作用,因此本研究分析了不同三聚氰胺浓度(0 g/L、1 g/L、2 g/L、4 g/L)胁迫处理嗜热四膜虫1 h后MTT1的表达情况,结果显示:处理组和对照组中,MTT1基因均有表达;且MTT1基因在嗜热四膜虫中的表达丰度随三聚氰胺浓度的增加而增大,4 g/L三聚氰胺处理下均达到最大,而在1 g/L三聚氰胺处理下,表达丰度最小,可见低浓度三聚氰胺对MTT1的表达影响不大。结果表明,较低浓度的三聚氰胺对单细胞生物的损伤较小,但高浓度的三聚氰胺对细胞有较大的损伤,与前面的实验结果相一致。综合上述试验结果可以看出,三聚氰胺能够影响单细胞真核生物四膜虫的增殖和有性生殖,浓度较高时对四膜虫的基因组起到一定损伤作用,也可以引起四膜虫细胞的凋亡。为了避免三聚氰胺给四膜虫造成的损伤,四膜虫体内的金属硫蛋白在三聚氰胺胁迫下进行了表达。