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泛素化及类泛素化修饰是广泛存在于真核生物体内重要的可逆翻译后修饰。典型泛素化修饰过程是泛素或者类泛素蛋白通过E1-E2-E3级联反应共价连接到底物蛋白的赖氨酸残基上。为了确保细胞内的泛素和类泛素蛋白准确参与到各自的修饰系统中而不发生紊乱,生物进化出了各种特异的E1激活酶。但是也有特殊的情况存在,比如激活酶（E1）Uba6能同时激活类泛素蛋白FAT10和泛素,以及本实验室之前的探究发现鱼类的激活酶（E1）Ube1L能同时激活类泛素蛋白ISG15和泛素。这些情况的出现表明泛素化修饰系统之间并非绝对平行,各通路之间存在着crosstalk。目前鲜有关于类泛素蛋白ISG15和泛素之间crosstalk的报道,启发于鱼类ISG15激活酶（E1）Ube1L能同时激活泛素和ISG15的研究,我们探究了斑马鱼泛素激活酶Uba1是否能同时激活泛素和其ISG15,即是否有ISG15和Uba1级联反应存在crosstalk的可能性。体外泛素化实验表明斑马鱼的泛素激活酶Uba1能成功激活其类泛素蛋白ISG15,但其被Uba1激活的速率较泛素慢。继而为了确定是否存在Uba1-ISG15 conjugation通路向泛素的E2-E3传递的可能性,我们表达纯化了斑马鱼的20种泛素转移酶（E2）以及1种泛素连接酶（E3）。体外实验发现由Uba1激活的ISG15,可以成功转移到泛素的E2乃至E3上。为进一步探究斑马鱼ISG15的“泛素-like”性质是否在物种间具有保守性,利用原核表达纯化的人类泛素激活酶Uba1和人类ISG15进行体外反应发现人类ISG15不能被人类Uba1激活,仅能被自身的E1酶Ube1L激活。不同物种ISG15性质差异的原因引起我们的兴趣。通过对斑马鱼Uba1-人类ISG15以及人类Uba1-斑马鱼ISG15的反应激活情况进行检测发现斑马鱼ISG15依然能被人类的Uba1激活,而人类ISG15不能由斑马鱼的Uba1所激活。由此表明泛素的E1激活斑马鱼ISG15并非物种的Uba1性质差异造成,而是斑马鱼ISG15似乎更加“像”泛素,因此具有能被泛素特异的激活酶Uba1激活的特性。这一发现赋予ISG15新的性质,拓宽了科学研究的领域。泛素激活酶Uba1激活泛素的机制在真核生物中非常保守,两者主要通过三个interface中关键残基的结合相互作用。对斑马鱼ISG15、人类ISG15和泛素的一级结构氨基酸序列进行比对,发现斑马鱼ISG15与泛素在氨基酸序列上的相似性较人类ISG15高,特别是泛素与Uba1结合的关键残基在斑马鱼ISG15中也相一致。有研究报道泛素第44位异亮氨酸和第42位精氨酸是与Uba1结合的关键位点,将斑马鱼ISG15对应位置的第125位异亮氨酸和第123位精氨酸分别进行点突变,突变成人类ISG15对应的125位苏氨酸和123位色氨酸。结果显示突变体ISG15被Uba1激活的能力极大降低,同时突变两个位点后则不再被Uba1激活。相反人类ISG15的125位苏氨酸和123位色氨酸分别突变成异亮氨酸和精氨酸后便可以被Uba1激活。由此可认为斑马鱼ISG15与Uba1的结合位点和泛素-Uba1相类似。关于泛素-Uba1 conjugation通路起源的研究,可以追溯到原核生物的Moe B-Moa D合成代谢通路,但ISG15的起源却未有解释。从斑马鱼到人类,类泛素蛋白ISG15丢失被Uba1激活能力的这一发现无疑为揭示ISG15的起源指明了方向。为探究ISG15具体的进化历程,我们对泛素和诸多类泛素蛋白进行了基因家族分析。选定不同进化阶段的代表物种,包括最原始的脊椎动物七鳃鳗;软骨鱼姥鲨;硬骨鱼斑马鱼、斑点雀鳝、腔棘鱼;两栖类非洲爪蟾;爬行类安乐蜥;鸟类鸡;哺乳类鸭嘴兽、负鼠和人类。从Pfam数据库里下载泛素结构原始的隐马尔可夫模型,用Hmmsearch方法在上述物种的蛋白组中寻找具有泛素特征的所有蛋白质,再以此为模板使用Hmmbuild方法构建出每一物种特异的泛素结构的隐马尔可夫模型,将各模型作为搜索工具在物种的蛋白组中进行二次深度搜索,从而寻找出未报道或数据库中未注释的各物种ISG15及其同源物（定义为ISG15like）。分析发现最早的无颌脊椎动物七鳃鳗中存在ISG15的直系同源物,但在鸟类和两栖类这两个分支中ISG15丢失。体外表达各物种的ISG15（ISG15 like）并进行Uba1激活实验后发现进化早期的物种无颌脊椎动物、软骨鱼和硬骨鱼ISG15（ISG15 like）都能被Uba1激活,爬行类安乐蜥ISG15 like和哺乳类ISG15则不再具有被Uba1激活的性质。对鉴定出的泛素基因家族的成员进行系统发育分析,发现isg15基因和编码多泛素链的基因ubb/ubc有着很强的进化关系,nedd8基因和编码泛素的融合基因有着很强的进化关系。这一系列证据都指向isg15起源于ubb/ubc。本实验围绕以上内容开展研究工作,取得以下结论:（1）斑马鱼的泛素激活酶Uba1能激活其类泛素蛋白ISG15,并能成功传递给泛素转移酶和泛素连接酶,人类ISG15则没有该性质。（2）与泛素-Uba1互作模型类似,斑马鱼ISG15和Uba1相互作用的关键位点是ISG15上的123位精氨酸和125位异亮氨酸。人类ISG15对应位置氨基酸进行W-R或T-I突变后则可被Uba1激活。（3）isg15起源于ubb/ubc,在进化过程中,其与泛素的相似性逐渐降低。约在爬行动物出现时期,ISG15丢失了“泛素-like”的性质,不再能被泛素激活酶Uba1激活。