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实验背景：肝细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内,其致死率在肿瘤相关疾病中排名第三位。近年来虽然早期诊断,以及放疗、化疗和手术治疗的联合使用使肝癌的治疗有了一定的提高,然而,到目前为止,肝癌患者的预后仍然不容乐观。最近有几篇报道表明DKK1的高表达和肝癌的发展密切相关。然而,DKK1在肝癌中的生物学功能及其分子机制仍不清楚。实验目的：本文以肝癌细胞和肝癌组织为研究对象,以期探讨DKK1在肝癌中的生物学功能及其潜在的作用机制。实验方法：采用RT-PCR和Western blotting实验检测正常肝细胞(QSG-7701)和四种肝癌细胞(Hep G2, SMMC-7721, HuH-7和BEL-7402)中DKK1mRNA和蛋白的表达。采用免疫组化法检测肝癌组织中DKK1和β-catenin的表达。采用MTT和克隆形成实验检测DKK1对肝癌细胞增殖的影响。采用划痕和Transwell实验检测细胞的侵袭和迁移能力。使用GSK3β抑制剂LiCl和β-catenin抑制剂IWP-2来进一步确认β-catenin在DKK1诱导的肝癌细胞侵袭和迁移中的作用。应用RT-PCR检测肝癌细胞中β-catenin,MMP7,以及LRP6mRNA的表达,采用Western blotting检测β-catenin, MMP7, LRP6, GSK3β和c-Myc等蛋白的表达。实验结果：1、与正常的肝细胞QSG-7701相比,DKK1的mRNA和蛋白水平在肝癌细胞系HuH-7, SMMC-7721和BEL-7402中明显高表达。值得注意的是：DKK1的mRNA和蛋白水平在BEL-7402细胞中表达最高,在Hep G2细胞中表达最低。2、当DKK1表达上调或者下调,肝癌细胞的增殖率并不改变。克隆形成实验结果显示：DKK1表达上调或者下调时只能微弱的增加或减少克隆数目,但与对照组相比并没有显著性差异。3、DKK1高表达能明显促进肝癌细胞的伤口愈合率,反之,当DKK1低表达时能显著降低肝癌细胞的伤口愈合率。Transwell实验结果显示：与对照组相比,DKK1稳定高表达的细胞表现出更高的侵袭和迁移率；稳定转染DKK1shRNA的肝癌细胞表现出更低的侵袭和迁移能力。与这些结果相一致的是,与健侧正常的肝组织相比,DKK1在肝癌组织中明显高表达；而且,与非转移性的肝癌组织相比较,DKK1在转移性的肝癌组织中表达更高。4、免疫组化结果表明：在肝癌组织中,DKK1的表达和β-catenin表达成正相关。而且,DKK1表达上调不仅能明显促进Hep G2细胞中β-catenin的mRNA和蛋白水平,而且能明显增加Hep G2细胞中β-catenin在细胞浆／细胞核的累积,以及增强具有野生型TCF结合位点的荧光素酶活性。反之,DKK1表达下调能明显减少BEL-7402细胞中β-catenin的mRNA和蛋白表达,以及降低具有野生型TCF结合位点的荧光素酶活性。5、使用β-catenin抑制剂IWP-2处理后,DKK1诱导的肝癌细胞的侵袭和迁移被明显降低。在稳定转染DKK1shRNA的肝癌细胞中,上调β-catenin的表达能部分恢复DKK1shRNA对β-catenin的转录和肝癌细胞的侵袭的抑制作用。同样,当使用GSK3β抑制剂LiCl处理后,DKK1shRNA对肝癌细胞的侵袭和迁移能力的抑制作用也被显著地解除。6、RT-PCR结果表明：尽管DKK1表达上调或者下调能显著改变β-catenin的mRNA水平,但并不影响LRP6细胞内域和细胞外域的转录。Western blotting结果同样表明：DKK1表达上调或下调不会影响LRP6细胞内域和GSK3β的蛋白表达。然而,DKK1表达上调或者下调能明显增加或者减少β-catenin和其下游靶点c-Myc的蛋白表达水平。进一步研究发现：β-catenin抑制剂IWP-2能明显抑制β-catenin的蛋白表达,而在稳定转染DKK1shRNA的肝癌BEL-7402细胞中,GSK3β抑制剂LiCl能部分恢复DKK1shRNA对β-catenin的蛋白表达的抑制作用。7、DKK1表达上调能显著增加Hep G2细胞中β-catenin的mRNA和蛋白水平,反之,当用shRNA沉默DKK1后,肝癌细胞BEL-7402中β-catenin的mRNA和蛋白水平显著地降低。而且,β-catenin抑制剂IWP-2能够剂量依赖性的降低肝癌细胞中MMP7蛋白的表达。与对照组相比,转染MMP7质粒的Hep G2细胞表现出更高的侵袭力。实验结论：1、DKK1在肝癌细胞中是高表达的。2、DKK1对肝癌细胞的增殖没有影响。3、DKK1显著促进肝癌细胞的迁移和侵袭,而且,DKK1在肝癌组织中明显高表达；此外,与非转移性的肝癌组织相比较,DKK1在转移性的肿瘤组织中表达更高。4、利用功能获得和功能丧失实验,我们证实DKK1是通过一种非经典的Wnt信号通路来促进肝癌细胞中β-catenin的表达,继而诱导肝癌细胞的迁移和侵袭。5、MMP7是β-catenin信号通路下游的一个重要靶点,它在DKK1介导的肝癌细胞侵袭中扮演着重要角色。