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类胡萝卜素是广泛存于在自然界中一组结构多样的天然色素。在高等植物中,参与光复合体的光捕获,保护光氧化损伤,是植物激素ABA的前体。在人体和动物中,类胡萝卜素作为抗氧化剂和维生素 A前体,是维持正常生命活动不可或缺的营养元素。枸杞富含类胡萝卜素且具有很强的环境适应性。然而,目前还没有关于枸杞类胡萝卜素生物合成基因的报道。 本研究利用3RACE技术首次从枸杞中分离到类胡萝卜素生物合成途径的六个关键基因:异戊烯焦磷酸异构酶基因(LcIPI)、八氢番茄红素合酶基因(LcPSY)、八氢番茄红素脱氢酶基因(LcPDS)、δ-胡萝卜素脱氢酶基因(LcZDS)、类胡萝卜素异构酶基因(LcCRTISO)和番茄红素ε-环化酶基因(LcLYCE)。生物信息学分析表明这六个基因在植物中高度保守。 利用大肠杆菌的颜色互补实验和高效液相色谱分析(HPLC)对克隆到的基因所编码的酶进行生物活性鉴定。结果表明:LcIPI能够催化异戊烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸间的异构化;LcPSY能够催化两分子牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸缩合成八氢番茄红素;LcPDS能够催化八氢番茄红素脱氢生成δ-胡萝卜素;LcZDS能够催化δ-胡萝卜素脱氢产生番茄红素;LcLYCE能够环化番茄红素产生叶黄素。克隆到的基因所编码的酶都具有生物活性。 通过农杆菌介导的遗传转化体系,获得过表达LcPSY、LcPDS、LcZDS、LcCRTISO和LcLYCE基因的烟草植株。各基因阳性转化株的类胡萝卜素含量均有不同程度提高。其中各基因对烟草类胡萝卜素含量的影响程度为:LcPSY>LcLYCE>LcCRTISO>LcPDS>LcZDS。 盐胁迫是限制粮食作物产量和分布的重要环境因素之一。类胡萝卜素在植物抵御不利逆境中发挥着重要作用。由于LcPSY基因过表达能够大幅提高转基因烟草的类胡萝卜素含量,本研究分析了LcPSY基因的抗逆功能。在盐胁迫条件下,相对空载体植株,转基因烟草具有较大的光合速率(Pn)和叶绿素荧光参数值(Fv/Fm),较高的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性,以及较低的过氧化氢(H2O2)和氧负离子(O-2)积累,说明LcPSY能够通过提高烟草的类胡萝素含量,从而减少活性氧(ROS)的积累,保护烟草免受氧化压力,提高了转基因植株的营养价值和耐盐性。