棉铃虫HaCHS和CDA基因的克隆、表达及FeedingRNAi分析

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棉铃虫(Helicoverpa armigera)是棉花的重要害虫,采用种植Bt棉和化学方法进行防治导致害虫出现抗性等一系列问题。RNAi技术因具有特异和高效的特点,而成为新型的害虫防治策略。靶基因的选择是成功的重要关键之一。几丁质是昆虫表皮和围食膜的主要成分之一,植物和高等动物中不存在;其代谢是昆虫的重要生化代谢过程之一。因此几丁质代谢相关基因有可能是RNAi技术防治害虫的理想靶标,具有重要的研究价值。本研究以棉铃虫体内的几丁质代谢相关基因CHS和CDA作为靶标基因,对其进行基因克隆和表达特征分析,并采用RNAi技术对其表型进行分析。从而为实现棉铃虫的有效控制提供科学依据。  本研究主要内容包括:⑴棉铃虫几丁质合酶基因的克隆与表达分析⑼通过RT-PCR技术首次在棉铃虫克隆出两个几丁质合酶基因:HaCHS1和HaCHS2;并得到了HaCHS1的两个剪接变体,分别命名为HaCHS1A和HaCHS1B。HaCHS1的两个交替外显子序列,只有177bp的差异,核苷酸和氨基酸水平上相似度分别为64%和69%。HaCHS1读码框4698 bp,编码1565个氨基酸;HaCHS2读码框4587bp,编码l528个氨基酸。RT-qPCR结果显示:HaCHS2只在肠道表达,在前肠中表达量最高,其次是中肠和后肠,而在其他组织则表达量极低;HaCHS1A主要在表皮中高表达,前肠和后肠也检测到少量的表达,而HaCHS1B在表皮,前肠和后肠中都高表达。HaCHS1A和HaCHS1B在幼虫期,蛹期和蛾期都有表达,其中蛹期表达量最高;而HaCHS2基因在卵期和幼虫期表达量高。⑵棉铃虫几丁质脱乙酰基酶2基因的克隆与表达分析⑼克隆了棉铃虫四个几丁质脱乙酰基酶基因(HaCDA1,HaCDA2,HaCDA5a和HaCDA5b),其中HaCDA2为新基因,该基因ORF为1611 bp,编码536个氨基酸,推测的蛋白分子量约为60.78 kDa,理论等电点为5.31。基于序列比对以及系统发育确认HaCDA2基因属于几丁质脱乙酰基酶1家族。RT-qPCR检测发现:HaCDA2基因只在脂肪体高表达;HaCDA2基因在幼虫期和蛹期表达量高。⑶目的基因RNAi干扰效率检测及表型观察。分别构建表达HaCHS、HaCDA的dsRNA的载体;用表达dsRNA(HaCHS1、HaCHS1A、HaCHS1B、HaCHS2、HaCDA1、HaCDA2、HaCDA5a和HaCDA5b)的HT115菌液喂食。RT-qPCR检测喂食处理2 d的幼虫发现,棉铃虫的靶标基因表达量都出现了下调,但是下降的幅度不同(以对照为100%,分别为73.1%、23.8%、14.0%、8.3%、82.9%、79%、38%、和51%)。在肠道有所表达的基因比非肠道基因沉默效率高。此外与对照组相比,dsCHS1、dsCHS1A、dsCHS1B、dsCHS2、dsCDA5a和dsCDA5b进行的饲料添加和叶片涂抹实验处理后,均可以在一定程度上抑制棉铃虫的生长发育;在棉叶上涂抹表达这些基因dsRNA的菌液,可以增加叶片对幼虫的抗性。
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