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第一部分:RNF10对代谢紊乱大鼠颈动脉再狭窄的作用目的:在代谢紊乱背景下血管新生内膜形成和再狭窄会加速发生发展。同时,血管平滑肌细胞增殖是再狭窄中的关键环节之一,会被环指蛋白10(RING finger protein 10,RNF10)所抑制。但是,RNF10对新生内膜形成的作用并不明确。在第一部分,我们探讨差异表达的RNF10对代谢紊乱大鼠颈动脉球囊损伤后再狭窄和新生内膜形成的作用。方法:所有Sprague-Dawley大鼠(N=135)均在无特定病原体动物级别环境中进行饲养,分别喂养普通饲料(Control组)和高脂饲料(high fat(HF)组)。检测体重和脂糖代谢指标。葡萄糖耐量试验评估胰岛素抵抗。淘汰经HF喂养后代谢仍然正常的大鼠。根据是否HF、球囊损伤(balloon injury,BI)、腺病毒转染(adenovirus,Ad)、绿色荧光蛋白空载体(green fluorescent protein,Ad-GFP)处理,所有大鼠进一步分成6组:1)Control组,N=16;2)HF+Sham组,N=20;3)HF+BI组,N=20;4)HF+BI+Ad-GFP组,N=21;5)HF+BI+Ad-RNF10组,N=21);6)HF+BI+Ad-sh RRNF10,N=21。14天后颈动脉切片行苏木精-伊红染色。结果:(1)与Control组比较,HF组大鼠体重(406.67±35.71 vs.372.20±33.41 g,P=0.009)增加。(2)与Control组比较,HF组大鼠空腹血糖(5.14±0.65 vs.4.00±0.40 mmol/L,P<0.001)升高,血胰岛素水平(22.81±3.19 vs.14.67±2.47μIU/m L,P<0.001)增加,葡萄糖耐量试验曲线下面积(38.90±5.73 vs.30.28±5.82,P<0.001)更大。(3)与Control组比较,HF组大鼠总胆固醇(100.25±15.08 vs.75.23±14.14 mg/d L,P<0.001)和低密度脂蛋白胆固醇(26.66±9.99 vs.16.80±5.15 mg/d L,P<0.001)均升高。(4)与HF+Sham组比较,HF+BI组大鼠颈动脉内膜与中层面积比(1.40±0.20 vs.0.10±0.02,P<0.001)增加。(5)与HF+BI+Ad-GFP组比较,HF+BI+Ad-RNF10组大鼠颈动脉内膜与中层面积比(0.47±0.12 vs.1.28±0.20,P<0.001)下降;HF+BI+Ad-sh RRNF10组大鼠颈动脉内膜与中层面积比(1.97±0.51 vs.1.28±0.20,P<0.001)上升。结论:RNF10基因过表达可以改善代谢紊乱大鼠的颈动脉球囊损伤后新生内膜形成和再狭窄,而RNF10基因干扰会促进颈动脉新生内膜生成。第二部分:RNF10对颈动脉新生内膜和血管平滑肌细胞增殖的影响及机制目的:在第二部分中,探讨RNF10通过颈动脉新生内膜和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型和细胞周期蛋白影响代谢紊乱大鼠颈动脉再狭窄的可能机制。方法:培养和鉴定原代大鼠VSMC,根据是否高糖(high glucose,HG)处理和腺病毒(adenovirus,Ad)转染分成5组:Control组、HG组、HG+Ad-GFP组、HG+Ad-RNF10组和HG+Ad-sh RRNF10组。定量聚合酶链反应检测颈动脉Cyclin D1、Cyclin E、Cdk2、Cdk4 m RNA信使核糖核酸(messenger ribose nucleic acid,m RNA)表达。Western blot检测RNF10,Cyclin D1和Cdk4等细胞周期相关蛋白,Osteopontin、α-SMA等VSMCs表型标志蛋白,MEOX2和AP-1等调控细胞周期的转录因子。结果:(1)与HF+BI+Ad-GFP组颈动脉比较,HF+BI+Ad-RNF10组颈动脉Cyclin D1蛋白(2.23±1.01 vs.3.75±1.20,P=0.037)、Cdk4蛋白(4.04±1.10 vs.8.43±3.74,P=0.047)表达均降低,而HF+BI+Ad-sh RRNF10组颈动脉Cdk4蛋白(14.71±6.61 vs.8.43±3.74,P=0.006)表达增加。(2)与HG+Ad-GFP组VSMCs比较,HG+Ad-RNF10组VSMCs的Cyclin D1蛋白(1.17±0.15 vs.3.61±1.21,P=0.002)表达减少;HG+Ad-sh RRNF10组VSMCs的Cyclin D1蛋白(6.38±1.18 vs.3.61±1.21,P=0.001)表达增加。(3)与HG+Ad-GFP组VSMCs比较,HG+Ad-RNF10组VSMCs的Osteopontin蛋白表达没有显著性变化,而HG+Ad-sh RRNF10组VSMCs的Osteopontin蛋白(0.83±0.64 vs.28.85±34.79,P=0.005)表达增加。(4)与HF+BI+Ad-GFP组颈动脉比较,HF+BI+Ad-RNF10组颈动脉MEOX2蛋白(0.44±0.10 vs.0.19±0.04,P=0.020)表达增加,AP-1蛋白(0.78±0.11 vs.1.34±0.29,P=0.025)表达下降。(5)与HG+Ad-GFP组VSMCs比较,HG+Ad-RNF10组VSMCs的AP-1蛋白(1.62±0.94 vs.2.96±0.87,P=0.003)表达减少;HG+Ad-sh RRNF10组VSMCs的AP-1蛋白(3.89±0.42 vs.2.96±0.87,P=0.037)表达增加,MEOX2蛋白(0.27±0.14 vs.1.42±0.32,P=0.001)表达下降。结论:RNF10基因过表达可能调控VSMCs的MEOX2和AP-1蛋白表达,继而抑制VSMCs表型变化和细胞周期蛋白Cyclin D1表达,最终抑制VSMCs增殖和颈动脉球囊损伤后新生内膜形成。第三部分:RNF10对颈动脉新生内膜和血管平滑肌细胞凋亡的影响目的:在第三部分中,探讨RNF10对颈动脉新生内膜和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)凋亡的影响。方法:原位末端标记法(Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL)染色检测颈动脉新生内膜的凋亡细胞比例。Western blot依次检测颈动脉的caspase-3、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达,依次检测VSMCs caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达。结果:(1)与HF+BI+Ad-GFP组颈动脉比较,HF+BI+Ad-RNF10组颈动脉新生内膜凋亡细胞比例(32.09±1.89 vs.24.90±3.68%,P=0.030)增加,而HF+BI+Ad-sh RRNF10组颈动脉新生内膜凋亡细胞比例(15.68±4.08 vs.24.90±3.68%,P=0.008)减少。(2)与HF+BI+Ad-GFP组颈动脉比较,HF+BI+Ad-RNF10组颈动脉cleaved caspase-3蛋白(6.11±3.82 vs.3.73±2.42,P=0.035)表达增加,而HF+BI+Ad-sh RRNF10组颈动脉caspase-3蛋白(1.15±0.38 vs.2.41±0.36,P<0.001)表达下降。(3)与HF+BI+Ad-GFP组颈动脉比较,HF+BI+Ad-RNF10组颈动脉组织的Bcl-2蛋白(0.61±0.28 vs.1.05±0.22,P=0.015)表达下降,而HF+BI+Ad-sh RRNF10组颈动脉Bax蛋白(0.85±0.36 vs.2.05±0.93,P=0.017)表达下降。(4)与HG+Ad-GFP组VSMCs比较,HG+Ad-RNF10组VSMCs的caspase-3蛋白(1.16±0.19 vs.0.75±0.06,P=0.005)表达增加,Bcl-2蛋白(0.92±0.35 vs.1.85±0.73,P=0.019)表达下降。结论:RNF10基因过表达可能通过抑制VSMCs的Bcl-2蛋白表达,促进VSMCs凋亡,进而抑制颈动脉球囊损伤后新生内膜形成。