日本脑炎（JapaneseEncephalitis，JE）是由日本脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)经蚊虫传播而引起的一种严重的人畜共患的病毒性疾病，日本脑炎病毒属于黄病毒科，黄病毒属，其基因组编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白，其中非结构蛋白病毒解旋酶(NS3)和病毒聚合酶(NS5)是与病毒复制相关的蛋白。本研究首先筛选确定了一条来自病毒自身的受体结合蛋白EDⅢ上的肽，并证明其在体外体内都具有抗JEV感染的活性，然后制备了JEVCore、NS3和NS5蛋白的多克隆抗体，并阐明了两个宿主蛋白解旋酶DDX3和DDX5在JEV复制过程中的作用及机制，为研究JEV的复制机理和抗病毒药物奠定了基础。　　主要研究内容分为以下4个部分:　　1.日本脑炎病毒入胞抑制肽的研究　　JEVE蛋白在病毒的入胞中具有重要的作用，其第三个结构域(EDⅢ)是潜在的受体结合区域，本研究根据JEVEDⅢ蛋白的空间结构，并结合文献报道筛选出四条可能与受体结合相关的loop肽，并进一步验证它们是否具有潜在的竞争性抑制JEV吸附和入胞从而抑制JEV感染的活性。这些肽经人工合成后，体外试验证明其中一条为loop3的肽能明显抑制JEV的感染，并且具有剂量依赖性和序列特异性，其半数抑制浓度为10μM;体内试验证明loop3肽在提前脑部注射的情况下能显著提高小鼠在致死剂量JEV攻毒下的成活率。由于loop3的序列与其他黄病毒属病毒存在一定的同源性，因此loop3肽为开发新的抗JEV和其它黄病毒属病毒的药物提供了新的思路和借鉴。　　2.日本脑炎病毒Core、NS3和NS5蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备　　将JEVCore、NS3和NS5甲基转移酶区域(Mtase)和NS5聚合酶区域（RdRp）蛋白的基因通过PCR方法进行扩增后，分别将目的片段克隆至原核表达载体pET-24a(+)中，通过18℃条件下IPTG诱导含有重组质粒的大肠杆菌BL21，SDS-PAGE分析证明重组蛋白在上清中获得表达，经过亲和柱纯化后得到较纯的目的蛋白，将纯化的各重组蛋白与等量弗氏佐剂乳化，经颈背部多点皮下注射免疫BALB/c小鼠3次后，收集小鼠血清，经ProteinG的层析柱纯化后，Westernblot和IFA试验确定这些蛋白的多克隆抗体分别能够识别纯化的重组蛋白和感染JEV的BHK-21细胞中的各病毒蛋白，制备这些多克隆抗体为后续研究JEVCore、NS3和NS5蛋白的功能和定位奠定了基础。　　3.宿主蛋白DDX3在日本脑炎病毒复制中作用的研究　　本研究中我们首先通过RNA干扰的方法证明干扰DDX3的表达后能明显抑制JEV的复制，说明宿主细胞中的DDX3在JEV复制中发挥了重要的作用，然后利用DDX3解旋酶活性特异性的抑制剂Cmp6，证明DDX3在JEV复制中的作用与其解旋酶的活性相关;GST-pulldown和免疫共沉淀试验显示DDX3与JEV的Core、NS3和NS5蛋白（甲基转移酶区域和聚合酶区域）有相互作用，激光共聚焦试验证明DDX3在感染和不感染JEV的情况下其在细胞内的分布没有明显的区别，但是内源的DDX3与JEV的Core、NS3和NS5蛋白在细胞质中共定位。此外DDX3还可以与日本脑炎病毒的5′和3′非编码区相互作用，并且与病毒新合成的RNA在细胞质中共定位，说明DDX3的确参与了病毒的复制。此外本研究通过噬斑试验、荧光定量PCR和westernblot试验证明在BHK-21细胞上转染DDX3进行过量表达也能明显的抑制JEV的感染，并且过量表达DDX3无解旋酶活性的突变体也能明显抑制JEV的复制，说明过量表达DDX3抑制JEV的活性与其解旋酶的活性无关，然后我们验证了在JEV感染状态下过量表DDX3及其酶活突变体均能诱导应激颗粒(stressgranule，SG)的产生，鉴于SG的形成能抑制病毒的感染，因此我们推断过量表达DDX3抑制JEV活性是通过诱导SG的产生实现的。本研究证明宿主的解旋酶DDX3在JEV的复制中发挥了重要的作用，而且过量表达DDX3能通过诱导SG的产生而抑制JEV，所以JEV的复制可能需要适量的宿主细胞蛋白DDX3。因此对DDX3在JEV感染中作用的研究对研究JEV的复制机理和开发抗JEV或其他黄病毒属病毒的药物是非常有意义的。　　4.宿主蛋白DDX5在日本脑炎病毒复制中作用的研究　　宿主解旋酶DDX5是与DDX3有密切关系的另一个解旋酶，其也广泛的存在于宿主细胞中，本研究通过DDX5shRNA干扰试验证明敲除宿主蛋白DDX5会影响JEV的病毒滴度、RNA复制和病毒蛋白表达，表明DDX5在JEV的复制中发挥了重要的作用，然后我们证明先敲除内源DDX5的情况下再转染DDX5解旋酶酶活突变体也能明显降低JEV的感染，显示DDX5的解旋酶活性对JEV的复制是必需的，GST-pulldown和免疫共沉淀试验证明DDX5能与JEV的Core、NS3和NS5蛋白（Mtase和RdRp）相互作用，并且在感染JEV的BHK-21细胞中，免疫共沉淀试验也证明DDX5与Core、NS3和NS5蛋白之间有相互作用，激光共聚焦试验证明内源的DDX5在JEV感染时能从细胞核中转移到细胞质中，并且在细胞质中与Core、NS3和NS5蛋白共定位，并且还与病毒新合成的RNA在细胞质中共定位，用药物LMB抑制DDX5出核时能抑制JEV的复制，说明DDX5的出核对JEV的复制是必需的。我们的RNA-pulldown试验证明DDX5能与JEV3′非编码区相互作用。因此DDX5在JEV的复制中有重要的作用，并且是通过参与病毒RNA的复制来发挥作用的，为以后研究抗JEV或其他黄病毒属病毒的药物提供了的靶点和依据。