论文部分内容阅读
目的:通过免疫荧光、蛋白印迹等细胞学及生物化学手段,深入分析人乳头瘤病毒相关蛋白E7在肿瘤化过程中的具体作用,明确出E7蛋白与DNA损伤断裂修复机制之间的联系。进一步分析出E7蛋白是否通过打破DNA双链断裂修复通路中同源重组及非同源末端连接修复通路之间的平衡,从而造成基因组的不稳定性,促使正常细胞肿瘤化。利用E7蛋白的特征从分子层面上提出可应用于临床的靶向治疗方案,首选同源重组修复缺陷类靶向药物PARP抑制剂作为宫颈癌的优选备用一线药物,将我国的宫颈癌患者治疗推进至副作用更低,疗效更好的靶向治疗阶段。方法:1.收集四川大学华西第二医院妇产科手术切除的新鲜不同阶段的宫颈组织:炎症、CINI、CINII、CINIII、CC,将这些组织处理后制成冰冻切片,通过免疫荧光染色观察DNA损伤情况;2.培养人肾上皮细胞系293T和HPV阴性宫颈上皮细胞系C33A,包装慢病毒pLV-E7-HA-Green以及作为对照使用的pLV-Green,用以感染293T和C33A细胞(观察绿色荧光和用WB检测慢病毒携带的标签蛋白HA判断细胞是否感染成功);3.离子射线和化疗药物喜树碱处理感染成功的293T细胞,western blot检测不同时间点细胞周期检验点相关蛋白的表达情况;4.离子射线和化疗药物喜树碱处理感染成功的293T细胞后,western blot检测不同时间点RPA32-S33和uH2B蛋白的表达情况,离子射线处理感染成功的C33A细胞,免疫荧光染色检测RAD51蛋白的表达情况;5.离子射线处理感染成功的293T和C33A细胞,免疫荧光染色观察各个时间点53BP1、BRCA1蛋白的表达水平;6.使用同源重组修复缺陷类靶向药物PARP抑制剂处理感染成功的细胞C33A-pLV、C33A-E7,药物浓度为:0.5/0.75/1/1.5Μm。药物处理14d后观察两种细胞的生存率。结果:1.宫颈组织冰冻切片免疫荧光染色结果:Ki67与γH2AX染色显示随着宫颈组织样本中分化程度的降低,蛋白表达量升高。进一步的,53BP1在宫颈癌前病变组织中信号随恶性程度增加而增强。2.细胞感染目的病毒E7和空载体病毒pLV后,免疫荧光观察到慢病毒所携带的绿色荧光,并且western blot实验检测到标签蛋白HA,表明293T和C33A细胞成功感染慢病毒pLV-E7-HA-Green和pLV-Green。3.Western blot实验结果显示:离子射线和化疗药物喜树碱诱导条件下,在E7存在的细胞中与细胞周期检验点相关蛋白Chk1-S345、NBS1-S343、ATM-S1981及p53-S15均明显减少。4.实验结果显示RPA32-S33、RAD51和uH2B在E7存在的细胞中对放化疗诱导的反应明显低于对照组。5.免疫荧光染色结果显示,在E7的作用下,53BP1蛋白表达增多,而BRCA1蛋白表达减少。6.使用不同浓度PARP抑制剂处理后,感染E7的细胞生存率明显低于对照组细胞生存率。结论:通过实验推测E7的存在可能造成宫颈上皮细胞的同源重组修复缺陷,这种缺陷导致细胞基因组不稳定性的产生,而细胞周期检验点的失活使这类具有不稳定基因组结构的细胞能够恶性增殖,最终导致宫颈组织肿瘤化。使用同源重组修复缺陷类靶向药物PARP抑制剂来治疗宫颈癌,有望提出可应用于临床的靶向治疗方案。