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糖尿病是一类由遗传、环境以及免疫等因素引起的以高血糖为特征的代谢性疾病,它主要分为l型和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)两种类型,其中T2DM患者占90%左右。T2DM的主要特征是周围组织的胰岛素抵抗(insulin resistant,IR)和胰岛β细胞分泌胰岛素相对不足。非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是T2DM和肥胖的一种较为常见的肝脏并发症。目前NAFLD发生发展的分子机制尚未完全明确。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是一种由于内外界环境变化和刺激而导致的错误折叠与未折叠蛋白质在内质网腔内聚集以及Ca2+平衡紊乱的状态。ERS对决定应激细胞的结局如抵抗、适应、损伤或凋亡发挥重要作用。近年来有关ERS信号通路与效应的研究非常活跃。研究表明ERS在IR、T2DM以及脂肪肝的形成过程中具有重要的作用。ERS可能通过影响糖脂代谢相关基因如固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding proteins-1c,SREBP-1c)等的表达,增加肝脏内脂肪酸的合成和积聚。同时ERS在肝细胞载脂蛋白B100(apolipo-protein B100,apoB100)的合成和分泌过程中也具有重要的调节作用,影响和制约着肝细胞内极低密度脂蛋白的分泌,进而引起肝脏脂质的积累。目前,针对ERS在T2DM患者(人及动物)脂肪肝发生过程中的作用机制的研究开始时间不长,ERS相关因子在脂肪肝发生过程中的作用机制尚不明确,仍需深入探讨。因此,为了探讨并论证ERS在T2DM脂肪肝发生发展的分子机制,本实验通过高脂饮食喂养联合链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导,在低密度脂蛋白受体基因缺失(LDLR-/-)小鼠的基础上建立了一种T2DM动脉粥样硬化小鼠模型。我们应用实时定量RT-PCR技术检测该模型小鼠与非糖尿病的单纯动脉粥样硬化(LDLR-/-)小鼠肝细胞ERS和脂代谢相关基因表达差异,并进行血生化指标检测及肝脏形态学观察。综合分析、探讨了ERS在T2DM小鼠脂肪肝形成和发展中的作用机制,为T2DM脂肪肝的预防和治疗,提供有价值的参考依据。1.T2DM动脉粥样硬化小鼠模型的建立我们选用3周龄雄性LDLR-/-小鼠,分成四组:组Ⅰ普通饲料对照组(普通饲料+柠檬酸,即CHOW+P);组Ⅱ普通饲料实验组(普通饲+STZ,即CHOW+STZ);组III高脂饲料对照组(高脂肪饲料+柠檬酸,即HF+P);组Ⅳ高脂饲料实验组(高脂肪饲料+STZ,即HF+STZ)。首先各组小鼠喂以相应饲料3周,于6周龄时禁食12h后,组Ⅱ和组Ⅳ小鼠按照100 mg/kg体重的剂量,腹腔注射STZ溶液;组Ⅰ和组Ⅲ小鼠腹腔注射相应体积的0.1mol/L无菌柠檬酸缓冲液。全部小鼠注射完毕后,继续饲喂相应饮食。待小鼠生长至10周龄时禁食12h检测血糖(glucose,GLU)和血清胰岛素(insulin,INS)水平,并计算胰岛素抵抗(insulin resistant,IR)指数,进行葡萄糖耐量试验。结果表明,与其它组相比,HF+ STZ组小鼠在10周龄时表现为高GLU、葡萄糖耐量异常以及IR增强,同时血清总胆固醇(totle cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)和游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)水平显著升高(P < 0.01),这表明我们已经在LDLR-/-基础上成功建立了T2DM动脉粥样硬化小鼠模型。2.T2DM相关指标的测定T2DM动脉粥样硬化成模小鼠(10周龄)及非糖尿病对照组小鼠(ND)继续喂喂以相应饮食,分别在10、14、18、26和34周龄解剖取材,进行如下指标的测定,结果如下:1)血生化指标检测:与ND小鼠相比,T2DM小鼠10周龄时表现为高GLU、葡萄糖耐量异常以及IR增强,并持续至34周龄。该组小鼠血清TC、TG、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和FFA含量于10周龄时较ND小鼠明显升高,并持续升高至34周龄。T2DM小鼠血清apoB100含量在10周龄时明显高于同龄ND小鼠(P < 0.01),18、26及34周龄时低于ND小鼠(P < 0.05)。肝功能指标血清丙氨酸氨基转移酶(alanine amino transferase,ALT)及天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate amino transferase,AST)分别从10和14周龄时显著升高(P < 0.01),持续升高至34周龄。从10周龄时T2DM小鼠肝脏TC和TG含量较ND组小鼠显著升高,并持续至34周龄(P < 0.01)。2)肝脏病理形态检测:中性脂肪染色(油红O染色)显示,T2DM小鼠10和14周龄时肝细胞质内出现大小不等的脂滴,呈现肝脂肪变性。18、26和34周龄时脂肪肝病变程度加重,并伴有局部炎症细胞浸润。各年龄段的ND小鼠肝脏组织结构完整,小叶结构清晰,肝细胞内均未观察到明显的脂质沉积。3)基因表达变化特征:与ND小鼠相比,T2DM组小鼠10周龄时肝脏ERS相关因子葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、葡萄糖调节蛋白94(glucose regulated protein 94,GRP94)、转录激活因子(activating transcription factor 4,ATF4)、X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)和tribbles同源蛋白3 (tribbles-related protein 3,TRB3)表达水平明显升高,并持续到34周龄(P < 0.05)。内质网相关性降解因子内质网甘露糖苷酶1样蛋白(ER degradation enhancer,mannosidase alpha-like 1,EDEM1)、DnaJ C类超家族同源蛋白3[DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 3,P58IPK]和热击蛋白70 (heat shock protein 70,Hsp70)的表达水平在18和34周龄,较ND小鼠显著升高(P < 0.05)。与ND小鼠相比,T2DM组小鼠脂代谢调控因子糖调节元件结合蛋白(carbohydrate response element binding protein,ChREBP)、SREBP-1c及生脂基因乙酰辅酶A羧化酶α(acetyl CoA carboxylaseα,ACCα)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS)和硬脂酰基辅酶A脱氢酶-1(Stearoyl-CoA desaturase-1, SCD-1)的表达显著升高(P < 0.05)。糖原合酶激酶(glycogen synthase kinase,GSK3β)、apoB100及甘油-3-磷酸转酰酶(glycerol phosphate acyltransferase,GPAT)的表达水平在10、18和34周龄时较ND小鼠明显升高(P < 0.05)。T2DM组小鼠转录因子肝X受体α(liver X receptorα, LXRα)和乙酰辅酶A羧化酶β(acetyl CoA carboxylaseβ,ACCβ)在10和18周龄时较ND小鼠显著升高(P < 0.05)。ERS通过上调GSK3β、SREBP-1c、FAS、ChREBP和ACCα等生脂基因的表达,并通过内质网相关性降解途径减少apoB100的合成和分泌,增加肝脏中脂质的积累,从而在T2DM小鼠脂肪肝的形成和发展过程中发挥重要作用。