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研究目的: 缺血预处理和后处理因其显著的心肌保护作用已经被广泛地应用于心肌缺血再灌注损伤的治疗中。在手术期间缺血事件是不可预测的，因此缺血预处理的广泛应用在一定程度上受到了限制。缺血后处理分为原位缺血后处理和远端缺血后处理(remote ischemic postconditioning，RIPostC)。虽然原位缺血后处理已经被证实能够减少心肌梗死面积并且保护心肌内皮功能但是原位缺血后处理会对动脉造成重复创伤，加剧动脉狭窄，最终导致缺血再灌注的损伤程度的加深。RIPostC是将远离缺血损伤器官的动脉血管重复缺血/再灌注从而实现缺血损伤器官的保护作用的一种有效的、可行的和无创的方法。大量的动物实验以及临床研究结果证实了RIPostC能够减轻心肌缺血再灌注造成的心肌损伤。但是，目前关于RIPostC诱导的心脏保护作用的分子机制仍然知之甚少。 乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase2，ALDH2)是一种位于线粒体中的参与酒精代谢的关键酶之一。ALDH2与氧化应激密切相关，它可以通过减少活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生发挥抑制细胞损伤的作用。ROS聚集是心肌缺血再灌注损伤发生的一个重要机制，而在生物体中线粒体是ROS的重要来源基于ALDH2位于线粒体中且对于氧化应激有着极为重要的调控作用我们猜测RIPostC的心脏保护作用可能与ALDH2的表达水平有一定的关联，但是目前相关的研究报道还比较少。 本实验研究了RIPostC对于心肌缺血再灌注损伤的体内和体外作用，同时检测了RIPostC处理对于小鼠心肌组织和大鼠H9c2细胞中ALDH2表达水平的影响。本研究旨在分析RIPostC的心肌保护作用与ALDH2表达水平的关系，为阐明RIPostC的心脏保护机制提供一定的理论依据。 研究方法: 第一部分 RIPostC减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤并上调ALDH2表达 选择雄性C57BL/6小鼠30只，分为三组:假手术组（Sham组），缺血再灌注组(ischemia/reperfusion，I/R)和I/R+RIPostC组。其中I/R组小鼠麻醉后切开气管并用呼吸机支持呼吸，同时开胸，将左冠状动脉前降支结扎45 min，之后松开血管2小时。Sham组小鼠麻醉开胸后只穿线，不接扎血管。I/R+RIPostC组小鼠穿线结扎缺血45 min，给与3轮5 min左股动脉缺血/5 min再灌注，然后再灌注90 min。经过处理的小鼠的左右心房和右心室被切除。 第二部分 RIPostC通过调控ALDH2表达减轻缺氧缺糖(oxygen-glucosedeprivation，OGD)/复氧复糖（OGD/re-oxygenation，OGD/R）诱导的心肌细胞损伤 实验一 RIPostC减轻OGD/R诱导的心肌细胞损伤 大鼠H9c2细胞分成3组:空白组(Control)，OGD/R组和OGD+RIPostC组。其中OGD/R组细胞经过3小时的OGD处理后，正常培养2小时，OGD/R组细胞经过3小时的OGD处理后，在正常培养90 min之前给与了3轮5 minOGD/5 min正常培养的处理。我们利用CCK-8法分析各组细胞的细胞活力，利用流式细胞仪分析各组的凋亡细胞的百分比，利用DCFH-DA作为荧光探针并利用流式细胞仪检测各组细胞中ROS的产生量，利用Western blot方法检测p53蛋白和凋亡相关蛋白的表达水平。 实验二 RIPostC促进ALDH2表达上调 大鼠H9c2细胞分成3组:Control，OGD/R和OGD+RIPostC。利用Westernblot方法检测各组细胞中ALDH2蛋白的表达水平。 实验三 RIPostC通过上调ALDH2表达减轻OGD/R诱导的心肌细胞损伤 H9c2细胞中利用慢病毒转染(sh-ALDH2)稳定地下调ALDH2的表达水平，其转染效率用Western blot方法检测。H9c2细胞分成5组:Control，OGD/R，OGD/R+RIPostC, OGD/R+RIPostC+sh-NC和OGD/R+RIPostC+sh-ALDH2。经过处理，我们检测了各组细胞的活力，凋亡，ROS产生，p53蛋白和凋亡相关蛋白的表达。 第三部分 RIPostC通过活化PI3K/mTOR信号通路促进ALDH2表达上调，减轻OGD/R诱导的心肌细胞损伤 大鼠H9c2细胞分别用PI3K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂Rapamycin处理0、6、12和24小时，利用Western blot方法检测细胞中PI3K，mTOR，磷酸化PI3K和磷酸化mTOR的蛋白表达水平。H9c2细胞分成4组:Control，OGD/R，OGD/R+RIPostC和OGD/R+RIPostC+LY294002/Rapamycin。利用Western blot方法检测处理后细胞中PI3K，mTOR，磷酸化PI3K和磷酸化mTOR的蛋白表达水平。 研究结果: 第一部分 RIPostC减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤并上调ALDH2表达 实验后，Sham组，I/R组和I/R+RIPostC组小鼠的左心室组织中ALDH2mRNA的相对表达水平分别为0.99±0.05，0.46±0.09，0.80±0.04，ALDH2蛋白的相对表达水平分别为1.00±0.05，0.37±0.07，0.79±0.08。与Sham组相比，I/R组的ALDH2 mRNA和蛋白的表达水平均发生显著的降低（P＜0.01）;与I/R组相比，I/R+RIPostC组的ALDH2 mRNA和蛋白的表达水平均发生显著的升高（P＜0.05），说明心肌缺血再灌注损伤能够导致ALDH2的表达水平的下调，而心肌缺血后的RIPostC步骤能够减轻ALDH2的表达水平的变化。 第二部分 RIPostC通过调控ALDH2表达减轻OGD/R诱导的心肌细胞损伤 实验一 RIPostC减轻OGD/R诱导的心肌细胞损伤 RIPostC能够减轻OGD/R诱导的H9c2细胞损伤。 实验二 RIPostC促进ALDH2表达上调 ALDH2可能参与了RIPostC在OGD/R处理的细胞中的心肌保护作用。 实验三 RIPostC通过上调ALDH2表达减轻OGD/R诱导的心肌细胞损伤 ALDH2敲低能够成功地逆转RIPostC对OGD/R损伤细胞的保护作用，也就是说RIPostC可能通过上调ALDH2表达来保护H9c2细胞免受OGD/R诱导的细胞损伤。 第三部分 RIPostC通过活化PI3K/mTOR信号通路促进ALDH2表达上调，减轻OGD/R诱导的心肌细胞损伤 LY294002处理细胞能够抑制PI3K及mTOR的磷酸化，Rapamycin处理细胞能够抑制mTOR的磷酸化。 与OGD/R+RIPostC组细胞相比，OGD/R+RIPostC+LY294002组细胞中ALDH2蛋白的表达水平发生显著下调(P＜0.01)。同样地，与OGD/R+RIPostC组细胞相比，OGD/R+RIPostC+rapamycin组细胞中ALDH2蛋白的表达水平发生显著下调（P＜0.01）。结果表明，PI3K/mTOR通路抑制能够降低RIPostC在OGD/R处理细胞中对于ALDH2表达量的影响。 研究结论: 本文在体内和体外验证了RIPostC处理对于心肌缺血再灌注损伤的保护作用;通过检测RIPostC处理后心肌细胞中ALDH2的表达量，分析了ALDH2敲低对于RIPostC心肌保护作用的影响;并且研究了PI3K/mTOR信号转导通路对于RIPostC调控的ALDH2表达水平的影响。本文对RIPostC在心肌缺血再灌注损伤中的作用及作用机制进行了深入的研究，结果显示: (1)在小鼠体内，RIPostC处理减少了心肌缺血再灌注导致的心肌梗死程度并 提高了心肌组织中ALDH2的mRNA和蛋白表达水平。 (2)在细胞水平上，OGD/R处理降低了H9c2细胞活力，提高了p53蛋白的表达水平，增加了凋亡细胞的百分比，促进了促凋亡因子Bax的表达和caspase-3的活化，抑制了抑凋亡因子Bcl-2的表达，并且增加了细胞中ROS的生成量。同时，我们发现RIPostC处理能够减轻OGD/R导致的这些指标的变化。 (3)在细胞水平上，OGD/R处理能够下调ALDH2蛋白的表达水平，而RIPostC处理能够逆转OGD/R导致的ALDH2蛋白水平的下调。 (4)在细胞水平上，ALDH2敲低能够逆转RIPostC对于H9c2细胞的保护作用，具体体现为减低细胞活力，上调p53蛋白的表达，增加凋亡细胞的百分比，上调Bax，活化caspase-3，下调Bcl-2和增加ROS的产生量。 (5)在细胞水平上，PI3K抑制或者mTOR抑制能够逆转RIPostC引起的ALDH2蛋白表达水平的上调。