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研究背景及目的原发性肝癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,在全世界范围内肿瘤致死率中排名第二。据统计,我国每年死于原发性肝癌的人数占全球原发性肝癌死亡人数的50%以上,严重威胁着人们的生命健康。肝癌的发生发展是一个涉及多种病因、多个因素在多阶段参与其形成的复杂的过程。抑癌基因的突变或缺失、原癌基因的激活、细胞周期调控异常以及DNA修复相关基因的异常表达等某一环节出现修复异常可能就是正常肝细胞发生癌变的临界点,有可能成为肝细胞出现癌变的标志。因此,肿瘤细胞中DNA的损伤修复机制是治疗肿瘤的一项有有希望的途径。p53结合蛋白1(P53 binding protein 1,53BP1)是一种参与DNA损伤修复的重要传感器,在保持基因组稳定性和预防癌症的发生方面起重要作用。53BP1基因定位于人类染色体15q15-21,有11.Okb和6.6kb两种转录本,该基因编码的蛋白质由1972个氨基酸残基组成,与p53的DNA结合区结合,从而促进p53介导的基因的转录启动。53BP1生理功能广泛,它能快速地聚集在DNA双链断裂部位并形成核聚物,因此,53BP1被认为是内源性DNA双链损伤的标志物分子之一。微小染色体维持蛋白(minichromosome maintenance protein,MCM)是真核细胞DNA复制前复合体的重要组成部分,可启动和参与DNA复制过程,为所有真核细胞DNA复制所必须的。研究发现,MCM蛋白主要参与染色体高级结构动态变化的许多个方面,如性染色体剂量补偿效应、姊妹染色配对、染色体浓缩与分离、DNA重组以及DNA损伤后的修复等过程。目前已有大量研究表明,MCM蛋白在乳腺癌、肺癌、霍奇金淋巴瘤等多种恶性肿瘤细胞中均呈高表达,可作为反映癌细胞增殖活性及判断其生物学行为的指标之一。本研究将首先利用转染技术下调53BP1在肝癌细胞株HepG2中的表达,构建好的稳定细胞株进行验证其表达水平。通过细胞克隆实验、MTS细胞增殖实验、荧光定量PCR、Western blot等技术,分析研究53BP1在肝癌细胞增殖中作用;通过质谱分析、免疫共沉淀、Western blot和免疫荧光等技术,分别研究53BP1与MCM复合物之间的相关调控关系,阐明53BP1通过结合MCM调控损伤DNA的复制,抑制了细胞的增殖,参与DNA损伤和细胞修复过程。最后,应用荧光定量PCR和Western blot检测53BP1在肝癌和癌旁的表达;免疫组化方法检测53BP1的表达。将53BP1的表达水平与患者的临床资料进行比较,多因素分析53BP1表达与肝癌患者生存预后的关系,阐明53BP1可能作为预测肝癌患者生存的保护因素。材料与方法第一章53BP1在人肝癌细胞HepG2 DNA损伤过程中的生物学作用本部分研究我们选取了人肝癌细胞株HepG2,通过构建shRNA慢病毒载体,利用转染技术将其转染入人肝癌细胞HepG2中,下调53BP1在肝癌细胞株HepG2中的表达,再通过荧光定量PCR、Western blot等实验技术要验证其稳定表达的细胞株构建是否成功。其次,应用MTS和细胞克隆形成实验验证53BP1对人肝癌稳定细胞株增殖能力的影响。最后通过应用博来霉素诱导DNA损伤探讨人肝癌细胞HepG2中变化。第二章53BP1与微小染色体维持蛋白复合物结合促进染色质分离和集落形成53BP1和MCMs构建的带有标记的重组载体被导入HepG2细胞中,免疫沉淀实验和质谱分析被用来鉴定53BP1和MCMs的可能的相互作用,GST下拉实验被用来检测直接的相互作用。shRNA用来抑制MCM2和MCM6的表达,以检测DNA损伤情况下,53BP1的染色质分离和集落形成。第三章53BP1在人肝癌组织中的表达及临床意义收集我院肝癌组织和癌旁组织的手术标本,应用荧光定量PCR和Western blot检测53BP1在肝癌和癌旁的表达;免疫组化方法检测53BP1的表达。将53BP1的表达水平与患者的临床资料进行比较,多因素分析53BP1表达与肝癌患者生存预后的关系。结果1.我们成功构建转染稳定下调53BP1表达的人肝癌细胞HepG2。shRNA-53BP1组细胞增殖能力明显强于shRNA-control组,53BP1可抑制人肝癌细胞HepG2的细胞增殖。博来霉素诱导了细胞出现DNA损伤显示53BP1在博莱霉素诱导的DNA损伤模型中表达是明显上调的,这说明DNA损伤过程中53BP1是被激活的。2.在肝癌细胞HepG细胞核内,MCM2/3/5/6与HA标记的53BP1共沉淀,GST结果显示53BP1和MCMs有直接的相互作用。下调MCM2或者MCM6后53BP1的染色质间质水平显著升高,而染色质水平显著降低。而且我们观测到敲除MCM2或者MCM6可以显著抑制DNA损伤后的53BP1的集落形成。3.53BP1的mRNA和蛋白表达在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织,免疫组化显示53BP1在肝癌组织中的表达较低。53BP1低表达与肿瘤大小、TNM分期密切相关;同时,53BP1被认为是肝癌患者总体生存率的保护因素。结论本研究结果提示下调53BP1的表达可以促进人肝癌细胞HepG2的增殖能力,且在DNA损伤过程中53BP1被激活。在肝癌细胞HepG2中,53BP1和MCM是直接相互作用的,这种直接作用是53BP1染色质分离和集落形成的必备条件。我们推测53BP1可能通过结合MCM复合物参与了 DNA损伤修复的过程。本研究结果为肝癌的诊断和治疗提供了新的靶点。