论文部分内容阅读
背景与目的肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其中80%左右为非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC）,而肺腺癌（Lung Adenocarcinoma,LAD）是非小细胞肺癌中较为常见的类型之一。化学治疗是目前晚期肺腺癌临床治疗的重要手段,但多药耐药是导致化疗效果不佳或失败的主要原因。因此,深入研究肺癌抵抗化疗的分子机制已成为临床亟待解决的关键性课题。近年来的研究表明,长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）可以通过与microRNA（miRNA）相互作用从而影响其下游的靶基因表达水平,进而参与细胞分化和个体发育调控,与疾病密切相关。根据已有的研究证实,上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）与化疗耐药表型的形成密切相关。本研究旨在探寻linc-ROR（regulator of reprogramming）通过EMT过程对人肺腺癌细胞化疗敏感性的调节作用,利用体内、外模型,从增殖、凋亡、细胞周期、侵袭和转移等方面探讨linc-ROR参与调节人肺腺癌细胞对多西他赛敏感性的可能机制及相关分子通路。材料与方法1.利用高通量lncRNA芯片技术,筛选人肺腺癌亲本细胞（SPC-A1、H1299）及耐药细胞（SPC-A1/DTX、H1299/DTX）的lncRNA差异表达谱,对结果进行荧光实时定量RT-PCR（real-time RT-PCR）验证。2.选定linc-ROR为研究对象,分别构建针对linc-ROR的慢病毒过表达（pLenti/linc-ROR）和 RNA 干涉载体（pLenti/linc-ROR-shRNA1-4）及其对照组,并将其分别感染人肺腺癌亲本（SPC-A1、H1299）和耐药（SPC-A1/DTX、H1299/DTX）细胞,进行稳定筛选（SPC-A1/ROR、H1299/ROR、SPC-A1/DTX/sh-ROR、H1299/DTX/sh-ROR）,人为改变细胞内linc-ROR表达水平后,在不同的药物浓度下（耐药细胞多西他赛0、50、100ug/L,亲本细胞多西他赛0、10ug/L）,MTT法分析细胞对多西他赛敏感性差异,克隆形成实验测定细胞体外增殖能力差异;流式细胞术检测细胞周期及凋亡率差异,划痕实验、transwell迁移和侵袭实验检测细胞体外迁移和侵袭能力的差异,Western blot和免疫荧光实验检测细胞中EMT分子标志物表达差异。3.将稳定干扰linc-ROR表达的SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞及其空白对照细胞注射入裸鼠皮下,构建裸鼠皮下移植瘤,成瘤后隔日腹腔内给予多西他赛注射,并绘制肿瘤生长曲线,适时处死动物后取瘤体组织,RT-PCR检测组织中linc-ROR表达水平,H＆E染色明确肿瘤结构,免疫组化染色分别检测增殖相关抗原Ki67、PCNA阳性率差异和EMT分子标志物及EMT关键作用元素ZEB1及ZEB2表达差异,TUNEL法检测瘤体细胞凋亡情况。4.选取linc-ROR的下游靶点。通过网站预测及相关文献的报道,筛选出于linc-ROR相互作用最明显的3条miRNA。通过RT-PCR检测过表达或干涉linc-ROR后这三条miRNA（miR-145、miR-133及miR-205）的表达水平变化,选取表达差异最大的miR-145作为进一步的研究对象。再通过RT-PCR检测人肺腺癌亲本及耐药细胞中miR-145的表达水平,同时检测过表达或干涉miR-145后linc-ROR的表达水平变化。网站预测linc-ROR与miR-145结合位点,双荧光素酶报告基因实验验证两者的结合关系。5.确定miR-145为linc-ROR靶基因,针对miR-145合成其类似物mimics和单链抑制物inhibitor（及其对照组）后,将其分别转染至人肺腺癌耐药及亲本细胞,人为影响miR-145的表达水平后,MTT法分析细胞对多西他赛敏感性差异,克隆形成实验测定细胞体外增殖能力差异,流式细胞术检测细胞周期及凋亡率差异,划痕实验、transwell迁移和侵袭实验检测细胞体外迁移和侵袭能力的差异,Western blot和免疫荧光实验检测细胞中EMT分子标志物表达差异。6.将亲本细胞分成linc-ROR空白对照组,linc-ROR过表达组,linc-ROR过表达及miR-145空白对照共转染组和linc-ROR过表达及miR-145 mimics共转染组,耐药细胞分成linc-ROR空白对照组,linc-ROR干涉组,linc-ROR干涉及miR-145空白对照共转染组和linc-ROR干涉及miR-145 inhibitor共转染组。MTT法分析细胞对多西他赛敏感性差异;克隆形成实验测定细胞体外增殖能力差异;流式细胞术检测细胞凋亡率差异;划痕实验、transwell迁移和侵袭实验检测细胞体外迁移和侵袭能力的差异。7.利用三个不同的miRNA靶基因在线分析软件:①TargetScanHuman 6.0（http://www.targetscan.org/）、②DIANA-microT v3.0（http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/）、③ Microrna.org（http://www.microrna.org/microrna/home.do）,对miR-145 可能结合的靶基因进行生物信息学预测分析,对结果进行RT-PCR、Western blot和双荧光素酶报告基因实验验证。8.选定FSCN1为miR-145候选靶基因,通过构建FSCN1基因过表达（及其空白对照质粒）及干扰质粒（及其空白对照质粒）,并分别转染至亲本及耐药细胞后,MTT法分析细胞对多西他赛敏感性差异,克隆形成实验测定细胞体外增殖能力差异,流式细胞术检测细胞凋亡率差异,划痕实验、transwell迁移和侵袭实验检测细胞体外迁移和侵袭能力的差异,Western blot和免疫荧光实验检测细胞中EMT分子标志物表达差异。结果1.根据基因芯片结果提示,耐药细胞组中linc-ROR的表达水平约是亲本细胞组的9倍,RT-PCR的结果与之相符。2.人为上调人肺腺癌亲本细胞linc-ROR表达水平后,细胞对多西他赛敏感性显著降低（p＜0.01）,细胞体外增殖能力增加（p＜0.01）,细胞早期凋亡率下降（p＜0.01）,细胞周期中S期比例增加（p＜0.01）,细胞的体外迁移和侵袭能力明显增加（p＜0.01）,细胞中上皮分子标志物（E-cadherin和β-catenin）表达下降,间质分子标志物（N-cadherin和Vimentin）表达上升;相反,在耐药细胞中人为下调linc-ROR表达水平后,细胞对多西他赛敏感性显著增加（p＜0.01）,细胞体外增殖能力下降（p＜0.01）,细胞早期凋亡率增加（p＜0.01）,细胞周期中S期比例下降（p＜0.01）并出现显著的G2/M期阻滞（p＜0.01）,细胞的体外迁移和侵袭能力明显下降（p＜0.01）,细胞中上皮分子标志物表达上升,间质分子标志物表达下降。3.在裸鼠移植瘤模型中,抑制linc-ROR表达可以与多西他赛产生协同作用,抑制SPC-A1/DTX及H1299/DTX细胞的成瘤能力,显著提高多西他赛的化疗敏感性,降低体内肿瘤细胞ki-67和PCNA的阳性率,促进细胞凋亡,同时EMT上皮标志物增加而间质标志物下降,ZEB1和ZEB2的表达均下降。4.在SPC-A1/DTX细胞（或H1299/DTX细胞）中,相对其他两个miRNA（miR-133及miR-205）,linc-ROR过表达或干涉之后,miR-145的表达水平变化最为明显。且在四株细胞中,亲本细胞中的miR-145的表达水平明显高于耐药细胞株,然而miR-145的表达变化并不能影响linc-ROR的表达水平。Linc-ROR上存在两个潜在的miR-145的结合位点,提示miR-145是linc-ROR的候选靶点,双荧光素酶报告基因实验亦证实了这一结果。5.人为下调亲本细胞中miR-145的表达水平后,细胞对多西他赛敏感性显著降低（p＜0.01）,细胞体外增殖能力增加（p＜0.01）,细胞早期凋亡率下降（p＜0.01）,细胞周期中S期比例增加（p＜0.01）,细胞的体外迁移和侵袭能力明显增加（p＜0.01）,细胞中上皮分子标志物（E-cadherin和β-catenin）表达下降,间质分子标志物（N-cadherin和Vimentin）表达上升;相反,在耐药细胞中人为上调miR-145表达水平后,细胞对多西他赛敏感性显著增加（p＜0.01）,细胞体外增殖能力下降（p＜0.01）,细胞早期凋亡率增加（p＜0.01）,细胞周期中S期比例下降（p＜0.01）并出现显著的G2/M期阻滞（p＜0.01）,细胞的体外迁移和侵袭能力明显下降（p＜0.01）,细胞中上皮分子标志物表达上升,间质分子标志物表达下降。6.拯救实验结果显示,miR-145可以显著逆转由linc-ROR所导致的化疗敏感性的下降、细胞增殖能力的增加、细胞凋亡率的下降以及细胞体外迁移和侵袭能力的增加（p＜0.01）。7.重组人肌成束蛋白（FSCN1）上存在一个miR-145的潜在结合位点,提示FSCN1可能是miR-145的靶基因,RT-PCR结果显示耐药细胞中FSCN1的表达明显高于亲本细胞,同时改变miR-145的表达水平并不能影响细胞中FSCN1的mRNA的表达水平变化,但可以影响FSCN1的蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验亦证实了这一结果。8.人为上调人肺腺癌亲本细胞FSCN1表达水平后,细胞对多西他赛敏感性显著降低（p＜0.01）,细胞体外增殖能力增加（p＜0.01）,细胞早期凋亡率下降（p＜0.01）,细胞周期中S期比例增加（p＜0.01）,细胞的体外迁移和侵袭能力明显增加（p＜0.01）,细胞中上皮分子标志物（E-cadherin和β-catenin）表达下降,间质分子标志物（N-cadherin和Vimentin）表达上升;相反,在耐药细胞中人为下调FSCN1表达水平后,细胞对多西他赛敏感性显著增加（p＜0.01）,细胞体外增殖能力下降（p＜0.01）,细胞早期凋亡率增加（p＜0.01）,细胞的体外迁移和侵袭能力明显下降（p＜0.01）,细胞中上皮分子标志物表达上升,间质分子标志物表达下降。结论与意义1.Linc-ROR在肺腺癌化疗耐药表型形成中发挥重要的作用,抑制其表达能够提高肺腺癌细胞对化疗药物的敏感性,抑制其增殖能力,增加早期凋亡率和改变细胞周期分布水平,同时能够抑制肺癌细胞的迁移、侵袭和转移能力,逆转EMT过程。2.MiR-145与linc-ROR负向相关,呈抑癌基因表现,与化疗增敏作用,增殖抑制,凋亡增加,细胞周期再分布及促进EMT过程密切相关。3.FSCN1作为miR-145直接靶基因,呈现癌基因表现,其表达的增加与肺腺癌化疗耐药表型的形成及EMT过程的产生密切相关。4.首次探讨了linc-ROR/miR-145/FSCN1功能轴调控异常在人肺腺癌化疗耐药及EMT过程中的重要作用,提示linc-ROR有望成为临床逆转肺腺癌化疗耐药的一个新型分子靶点。