第一部分脂肪组织特异性敲除Nrf2小鼠通过调节糖脂及能量代谢延缓高脂饮食诱导的肥胖研究背景和目的:核转录因子Nrf2是熟知的抗氧化应激和降解毒素的总管因子。白色脂肪组织是能量储存库,也是内分泌器官,分泌多种免疫和炎症介质调节心血管疾病、胰岛素抵抗、2型糖尿病和脑功能失调等。最近有研究表明,全身性敲除Nrf2小鼠可以调节糖脂及能量代谢。为了理解Nrf2在脂肪生成和脂肪功能中的复杂作用,本实验研究了脂肪组织特异性敲除Nrf2小鼠对饮食诱导肥胖的影响。实验方法:本实验利用转基因小鼠杂交技术成功获得脂肪组织特异性敲除Nrf2(ASAN/NK)小鼠模型。选取6周龄ASAN(NK)小鼠和Nrf2对照小鼠(NC),分别给与14周对照饮食(CD)或高脂饮食(HFD)。本实验分成四组,分别为:对照饮食的Nrf2对照小鼠组(NC-CD)、高脂饮食的Nrf2对照小鼠组(NC-HFD)、对照饮食的ASAN小鼠组(NK-CD)、高脂饮食的ASAN小鼠组(NK-HFD),每组各6只。记录小鼠每周体重变化,并用活鼠身体组成分析仪检测小鼠总体脂及肌肉含量。在CD/HFD喂食第8周时用最大氧耗间接热量测定系统持续监测小鼠一周新陈代谢水平。在第20周时,分别检测实验鼠和对照鼠糖耐量情况;从心脏采血用ELISA试剂盒检测血清中游离脂肪酸、总胆固醇、瘦素和脂联素含量。提取各组小鼠全部皮下及脏器脂肪组织,称重。用HE染色检测每组小鼠白色AT大小形状特征。用Western Blot和q PCR研究各组小鼠脏器脂肪组织中糖脂及能量代谢相关蛋白和基因表达情况。实验结果:在5-11周高脂饮食喂养期间,NK-HFD组小鼠相对于NC-HFD组小鼠体重增长延缓;在CD和HFD饮食条件下,NK小鼠相对于NC小鼠表现出更高的身体活动水平;NK-CD组小鼠相对于NC-CD组小鼠优先选择脂肪而非糖类作为能量来源;高脂饮食14周后,NK小鼠体重和体脂相对于NC小鼠未见明显不同,但其血糖降低,脂肪细胞数量减少、体积变大,并且伴随着脏器脂肪中大量与糖脂及能量代谢相关基因和蛋白表达上调(如FGF21,PGC1α等)。实验结论:Nrf2在脂肪组织中发挥重要的调节糖脂及能量代谢的作用,并且ASAN小鼠在抑制高脂饮食诱导肥胖早期起保护作用。第二部分Nrf2对小鼠巨噬细胞炎症和糖代谢的多重调节作用研究背景和目的:本实验第一部分通过构建ASAN(Nrf2flox/flox,a P2-Cre+/-)转基因小鼠,研究发现了Nrf2在脂肪组织中发挥重要的调节糖脂及能量代谢的作用并且ASAN小鼠在抑制高脂饮食诱导肥胖早期起保护作用。脂肪组织主要包含脂肪细胞和巨噬细胞,而a P2-Cre基因受a P2启动子调控,在脂肪细胞和巨噬细胞中均有表达,因此ASAN小鼠的表型应是Nrf2调控脂肪细胞和巨噬细胞的共同作用结果。巨噬细胞分泌的细胞因子经内分泌和旁分泌作用影响周围组织功能和稳态,其产生的炎症介质更是肥胖相关代谢紊乱的病原学基础。为了更好地细分Nrf2在脂肪细胞和巨噬细胞中的作用,本实验第二部分研究了Nrf2对小鼠巨噬细胞炎症和代谢调节作用。实验方法:我们利用Nrf2逆转录病毒特异性敲低RAW264.7巨噬细胞Nrf2基因,构建Nrf2敲低的巨噬细胞模型,并用100ng/ml脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞成M1激活状态。本实验分四组,分别为:正常对照巨噬细胞组(Con)、Nrf2敲低巨噬细胞组(NK)、M1激活巨噬细胞组(M1)、Nrf2敲低且M1激活巨噬细胞组(NK-M1)。利用q PCR,Western Blot和ELISA等方法来检测敲低Nrf2对巨噬细胞炎症和糖代谢的影响。分别收集四组巨噬细胞(Con,NK,M1,NK-M1)条件培养基(CM)并用来干预原代内皮细胞,通过q PCR和Western Blot检测内皮细胞经各组CM刺激后,其炎症和衰老相关指标的变化。实验结果:q PCR结果表明,敲低Nrf2基因显著提高静息巨噬细胞炎症因子Il1α和Il1β基因表达;在M1细胞中增加炎症基因Il1a,Il1b,Il6,Il10,Ccl2,Ccl22和CD38表达,降低Tnfα和Tgfβ1基因表达。敲低Nrf2还显著提高M1细胞IL6和IL10的分泌。WB结果显示敲低Nrf2减少静息细胞i NOS蛋白水平并增加静息状态和M1激活状态巨噬细胞CD38蛋白水平。Nrf2对这些巨噬细胞炎症和极化指标的不同调节揭示了Nrf2在调节巨噬细胞炎症中的多重作用。另外,在M1巨噬细胞中敲低Nrf2增加Glut4蛋白水平,减少磷酸化的AKT和GSK3β蛋白水平,提示Nrf2在调节巨噬细胞糖代谢中的多重作用。Con-CM和NK-CM组内皮细胞处于较低炎症状态,M1-CM和NK-M1组炎症和衰老指标显著提高;与M1-CM组相比,NK-M1-CM组内皮细胞炎症水平更高,同时其衰老相关指标P53和P21的蛋白表达水平也明显升高,提示Nrf2调控巨噬细胞内分泌作用可以影响内皮细胞炎症和衰老。结论:我们的结果首次揭示了Nrf2在巨噬细胞炎症和糖代谢中的多重调节作用,并且这种作用独立于其经典的抗氧化应激作用。Nrf2可以通过调控巨噬细胞细胞因子的分泌来影响内皮细胞炎症和衰老。这些结果支持Nrf2作为预防和治疗包括炎症、AS、肥胖和糖尿病在内的衰老相关疾病的潜在治疗靶点。