红花檵木LcCHI、LcANS基因的克隆、表达分析及转化的研究

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红花檵木(Loropetalum chinense var.rubrum)为金缕梅科檵木属植物檵木的变种。红花檵木叶红花红,是我国特色的观花观叶植物。因其易于繁殖,具有较强的适应性和抗逆性,且耐修剪,易造型,一年可多次开花,是我国南方省份常用的园林绿化及造景植物。红花檵木的叶片红色是由其中丰富的花青素物质所决定的,夏季长时间高温天气会引起红花檵木叶片由红变绿,从而严重影响其观赏价值,也降低了其经济价值。因此,需要对红花檵木的花青素物质积累的相关分子机制进行研究,从而为进一步开展红花檵木的分子育种及品种改良创造条件。本研究基于红花檵木转录组测序结果,从中筛选出花青素生物合成途径重要基因查尔酮异构酶基因(Lc CHI)和花青素合成酶基因(Lc ANS),并进行了相关的基因功能研究。利用转录组测序数据和RT-PCR技术,从红花檵木中克隆到Lc CHI和Lc ANS的c DNAs序列,获得了这两个基因的开放阅读框(open reading frames,ORFs)序列。分别对Lc CHI和Lc ANS基因编码的氨基酸序列进行预测,并开展了氨基酸性质分析、氨基酸序列的多重比对、系统进化分析、三级结构建模等分析。采用实时荧光定量PCR技术对Lc CHI和Lc ANS的表达进行了分析。同时构建了p Lc CHI-SUPER1300和p Lc ANS-SUPER1300过表达载体,并在拟南芥中异源表达,获得了转基因植株,这为进一步对这两个基因在红花檵木花青素生物合成中的功能研究奠定了基础。主要结果如下:(1)克隆了红花檵木查尔酮异构酶编码基因Lc CHI,其ORF全长为657 bp,编码218个氨基酸。相对分子量为为53.6k Da,等电点为5.16。氨基酸序列的多重比对结果表明,红花檵木的Lc CHI和来自玫瑰、月季、茶树等植物的CHIs的氨基酸序列一致性很高,均超过75%。红花檵木Lc CHI中5个与酶催化相关的氨基酸残基(Arg38、Thr46、Tyr108、Asn115和Ser192)在这些物种中完全一致,可见Lc CHI在进化上的高度保守性。系统进化研究表明,Lc CHI与玫瑰和月季的亲缘关系较近。Lc CHI蛋白三级结构建模显示,Lc CHI与来源于拟南芥的At CHI的晶体结构模型匹配度较高,主要由多个α螺旋和β折叠片形成球状蛋白,其催化区域有两个硝酸根离子(NO3-)结合位点。实时荧光定量PCR结果表明,Lc CHI基因在不同组织中均有表达,这与这些组织中均表现为红色相关,其中根中表达量最高,嫩叶、茎、花次之,成熟叶最低。(2)克隆了红花檵木花青素合成酶编码基因Lc ANS,其ORF全长为1071 bp,编码356个氨基酸。相对分子量为为87.5k Da,等电点为5.07。氨基酸序列的多重比对结果表明,红花檵木的Lc ANS与来源于牡丹、芍药、鸡爪槭等植物ANSs的氨基酸序列一致性高,均超过84%。系统进化研究表明Lc ANS与来源于毛茛科芍药属的芍药和牡丹的ANSs亲缘性较近。三级结构建模分析表明,Lc ANS与来源于拟南芥的At ANS的晶体结构模型匹配度很高,Lc ANS蛋白形成球状蛋白,拥有较多的α螺旋和β折叠片,其核心区域包含有2个配基(Fe2+和2-酮戊二酸)和1个类黄酮底物的结合位点。实时荧光定量PCR分析表明,高温胁迫条件下红花檵木叶片Lc ANS基因的相对表达量会显著降低,在高温处理48-96 h的时候,Lc ANS基因的相对表达量仅为处理前的1/10。(3)扩增了红花檵木Lc CHI和Lc ANS的ORFs序列,并构建了基因的过表达载体p Lc CHI-SUPER1300和p Lc ANS-SUPER1300,异源转化拟南芥并获得了转基因阳性植株。
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