现在人们多数工作节奏快、生活压力高,持续的应激反应导致生活不规律,出现睡眠不足或质量下降等症状,此时机体激活“下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）”来维持内环境稳态。长期过度的应激反应更会使体内昼夜节律生物钟紊乱、进而导致神经功能调节失调、激素水平失衡和机体的物质代谢和能量代谢的紊乱。随着应激程度的加深和应激时间的延长导致机体自我调节修复的失代偿,将进一步诱发机体多系统多器官的病变和紊乱,如焦虑、失眠、抑郁、心脑血管疾病、糖尿病甚至恶性肿瘤的发生,作为机体营养物质代谢中枢的肝脏也会因应激而出现不同程度的失代偿进而导致肝损伤,被称为“应激性肝损伤”（Stress-induced injury,SLI）。SLI在人们的日常工作生活中是普遍存在的,如不及时加以干预,肝功能受损将逐渐发展为脂肪肝,重则肝纤维化甚至肝癌。目前,引起SLI的确切病因尚未彻底阐明,临床上仍缺乏对抗SLI的特效药物。因此,通过建立一个可模拟人体体内发生的应激性肝损伤的动物模型,利用差异基因表达筛选出应激相关基因,干预或逆转基因的表达,发现可用于诊断应激性肝损伤的生物标志物,或者寻找到可用于预防和治疗应激性肝脏损伤的新药,为临床诊断和治疗应激性肝损伤提供理论基础。本文主要通过以下几个章节进行研究:第一章:SD大鼠应激性肝损伤模型的建立及确认。（1）模型建立方法:采用水浸束缚法将14只大鼠每天束缚10小时（7:00a.m.-5:00p.m）,水温20连续束缚21天建立大鼠SLI的模型。分为空白对照组（NC）和应激性肝损伤组（SLI）。（2）模型的确认:与NC组相比,慢性束缚应激大鼠体重减轻（P<0.001）,肝脏系数（P<0.01）和肝脏湿干比重增加（P<0.001）,表明在肝损伤的情况下发生了肝脏肿胀。另外血清学水平上CORT升高（P<0.001）;血清AST（P<0.001）、ALT（P<0.001）和ALP（P<0.01）的升高证明水浸束缚大鼠的肝功能出现异常。HE染色结果表明,水浸束缚及由此导致的心理情绪应激会导致肝脏的器质性功能改变。以上结果共同证实了慢性水浸束缚引发应激,并且应激性肝损伤造模成功。第二章:应激性肝损伤差异基因表达及富集信号通路的生物信息学研究。通过对大鼠肝脏的转录组测序,找出NC组与SLI组的差异基因,GO和KEGG分析可能导致差异的通路,通过Cytoscape软件对找到的差异基因可视化展示,分析导致SLI的原因,拟找到关键基因和生物标志物。通过GO、KEGG和系统药理学分析,发现SLI发生时:（1）昼夜节律时钟基因受到影响,时钟节律被破坏如Arntl上调,Per1和Cry1下调;（2）昼夜节律时钟基因的表达异常导致肝脏的脂质代谢紊乱（包括脂质合成的增多（如Scd上调）、脂质分解的减少（如Cpt1a和Decr1下调）和脂质转运的障碍（如Pparα下调））;通过检测血清TC（P<0.01）、TG（P<0.001）的水平,油红O染色验证肝脏脂质的累积情况。（3）致炎脂质合成的累积导致炎症反应及肝损伤的发生,如急性反应期蛋白Orm1上调、细胞因子Tnfaip3增多,引发SLI。血清炎症因子IL-1β（P<0.001）和TNF-α（P<0.001）的显著增加验证SLI时炎症反应增加。第三章:昼夜节律基因异常表达及褪黑素对应激性肝损伤的保护作用研究。通过转录组m RNA测序,基因差异表达分析发现,肝脏组织中参与时钟调控的基因Arntl在应激性肝损伤中出现高表达,Per1和Cry1出现低表达,而褪黑素（MLT）具有调节昼夜节律的作用。（1）本文使用2.5mg/kg的褪黑素（MLTL）和5mg/kg的褪黑素（MLTH）于造模前1小时进行干预,观察是否可以通过调节昼夜节律基因Arntl,进而发挥对抗因水浸束缚法造成的大鼠应激性肝损伤。（2）结果显示:（1）不同剂量褪黑素可增加应激大鼠的体重,降低肝脏系数和肝脏湿干比重;MLTH可降低大鼠血清CORT水平（P<0.05）;MLTL和MLTH均可降低血清ALT（P<0.01,P<0.05）和AST水平（无统计学差异,P<0.01）;HE染色观察改善肝脏组织学变化,说明褪黑素可有效对抗应激性肝损伤。（2）qPCR显示,与SLI组相比,MLTH可逆转Arntl m RNA的升高（P<0.05）,MLTL和MLTH均逆转Cry1m RNA的下调,虽然无显著统计学差异,说明褪黑素改善了应激性肝损伤大鼠昼夜节律紊乱的状态。（3）与SLI组相比,MLTL和MLTH显著降低了血清TC水平（P<0.01,P<0.001）,MLTH降低血清TG水平（P<0.05）、油红O染色可见改善了肝脏中脂质的积累。免疫组化法可见MLTL和MLTH均可增加肝脏中脂质代谢关键基因Pparα和Cpt1a蛋白表达,且高剂量组差异更显著（P<0.05,P<0.01）。（4）MLTL给药降低了血清的IL-1β和TNF-α（P<0.05）的含量,MLTH降低的水平更为显著（均为P<0.001）;同时,MLTL和MLTH使肝脏中急性期蛋白Orm1和炎症因子Tnfaip3的m RNA表达较SLI组降低,表明褪黑素给药抑制SLI发生时的炎症反应。（5）Western blot显示大鼠应激后肝脏中Ampk、Pparα和Cpt1a蛋白含量减少,MLT给药后,三者表达情况均有不同程度的增加。（3）小结:给予褪黑素后,改善了应激大鼠昼夜节律紊乱的状态,降低了应激大鼠血清CORT、ALT、AST水平,阻止了肝脏脂肪变性的发生,降低致炎细胞因子的水平,抑制SLI发生时的炎症反应,作用机制与阻止Ampk、Pparα和Cpt1a蛋白含量的减少有关。第四章:Pparα在应激性肝损伤中的异常表达及其激动剂WY14643对应激性肝损伤的保护作用研究。通过转录组对mRNA测序和对基因差异表达的分析发现:肝脏组织中Pparα下调表达,本部分内容采用其激动剂WY14643观察对SLI的作用。（1）建立SLI模型,给予低剂量WY14643（WYL）0.5mg/kg和高剂量WY14643（WYH）1mg/kg造模前1小时进行干预。（2）实验结果表明:不同剂量WY14643给药后,大鼠体重较SLI组增加,肝脏系数和肝脏湿干比重较SLI组降低,血清CORT的升高也得到改善;与SLI组相比,WYL和WYH剂量依赖性地降低血清ALT和AST水平（P>0.05,P<0.05）,也降低血清细胞因子IL-1β（P<0.01,P<0.001）水平,对TNF-α水平的改变无统计学差异;同时降低血清TC和TG水平（P>0.05）,油红O染色可见改善了肝脏中脂质的积累。HE染色显示,WY14643给药可明显改善肝脏组织学变化。提示,WY14643具有抗SLI的药理学效应。（3）Pparα激动剂抗SLI机制研究:（1）WY14643对昼夜节律时钟的影响:与SLI组相比,WY14643给药可逆转Arntl m RNA（P<0.05,P<0.001）和Cry1 mRNA（P>0.05,P<0.01）的表达,提示Pparα激动剂也具有调控昼夜时钟节律的作用。（2）给予WYL和WYH后,免疫组化显示肝脏组织中Pparα（P<0.05,P<0.001）和Cpt1a（P>0.05,P<0.001）的表达量较SLI增多;肝脏中Orm1（P<0.01,P<0.001）和Tnfaip3（P<0.001,P<0.001）的m RNA表达较SLI组降低,表明WY14643给药可以阻止脂肪异常代谢和由于脂肪异常代谢导致的炎症反应。（3）WY14643能有效抑制应激性肝损伤后肝脏Ampk、Pparα和Cpt1a蛋白的降低,使Ampk增加5.3%和16.5%（P<0.01）,Cpt1a表达增加3.4%和15.1%（P<0.01）,低剂量WY14643使Pparα表达增加6.8%,但高剂量给药并未使Pparα表达增加。（4）小结:Pparα激动剂WY14643也可以通过调节昼夜时钟分子Arntl和Cry1纠正应激性肝损伤过程中脂质的异常代谢和炎症反应,恢复参与物质代谢和能量代谢的信号分子Ampk、Pparα和Cpt1a蛋白水平,达到抗SLI的作用。综上所述:SLI发生不是单一基因或者信号通路发生改变,而是机体的主要调控系统都发生了适应性的变化,可归纳为:昼夜节律时钟——内分泌——脂质代谢——免疫轴的改变。通过基因差异表达研究发现,昼夜节律的Arntl和Per1,以及脂质代谢的Pparα共同参与了SLI的发生。给予了昼夜节律调节剂褪黑素和脂质代谢调节剂Pparα激动剂WY14643可对抗SLI,其可能纠正了应激性肝损伤大鼠生物钟紊乱的状态,减少了肝脏脂质堆积,抑制了炎症反应的发生,作用机制与激活Ampk/Pparα/Cpt1a途径有关。