【摘 要】
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卵泡的正常发育是雌性哺乳动物具备生殖功能的先决条件,卵泡的发育和成熟过程往往伴随着颗粒细胞的的增殖和分化,而颗粒细胞的凋亡则会引起卵泡的闭锁。因此深入研究颗粒细胞的增殖凋亡机制将有利于保障卵泡的正常发育过程。本文以大足黑山羊的卵巢颗粒细胞为研究对象,通过过表达或敲低SMAD7、免疫组化、RT-PCR、Western Blot等技术,探究SMAD7对颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素分泌及TGF-β/S
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（2018YFD0502003）； 中央高校基本科研业务费（XDJK2020B013）；
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卵泡的正常发育是雌性哺乳动物具备生殖功能的先决条件,卵泡的发育和成熟过程往往伴随着颗粒细胞的的增殖和分化,而颗粒细胞的凋亡则会引起卵泡的闭锁。因此深入研究颗粒细胞的增殖凋亡机制将有利于保障卵泡的正常发育过程。本文以大足黑山羊的卵巢颗粒细胞为研究对象,通过过表达或敲低SMAD7、免疫组化、RT-PCR、Western Blot等技术,探究SMAD7对颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素分泌及TGF-β/SMAD信号通路的影响,为揭示TGF-β/SMAD信号通路在卵泡发育中的功能提供实验和理论依据。本研究得到了以下结果:1.构建的SMAD7-pcDNA3.1（+）-N-e GFP过表达载体成功转染进山羊颗粒细胞中,过表达效率是2 505倍;设计的三条si SMAD7序列的干扰效率分别为75.3%±0.4%、64.5%±5.1%、59.2%±4.2%,其中siRNA1的干扰效率最高,干扰效率满足后续实验要求。2.SMAD7过表达或干扰后,利用CCK8检测山羊颗粒细胞活力,发现过表达组的细胞增殖活力显著低于对照（NC）组（P＜0.05）,敲低组的细胞增殖活力显著高于siRNA-control组（P＜0.05）,说明提高SMAD7的表达能够抑制颗粒细胞的增殖,降低SMAD7的表达则能够促进颗粒细胞的增殖;进一步研究发现,SMAD7过表达组中PCNA的m RNA和蛋白表达水平较NC组极显著下降（P＜0.01）,而siRNA-SMAD7组中PCNA的m RNA和蛋白表达水平较siRNA-control组极显著提高（P＜0.01）,结果表明SMAD7抑制颗粒细胞的增殖。3.利用流式细胞术检测细胞的凋亡情况,结果显示,SMAD7过表达组的凋亡率极显著高于NC组（P＜0.01）,但与siRNA-control组相比,siRNA-SMAD7组的凋亡率没有显著性差异（P＞0.05）,说明SMAD7过表达能够促进颗粒细胞的凋亡。进一步检测发现,SMAD7过表达组中BCL2/BAX比值极显著低于NC组（P＜0.01）,siRNA-SMAD7组中BCL2/BAX比值显著高于siRNA-control组（P＜0.01）,说明SMAD7是颗粒细胞的促凋亡因子。4.通过ELLSA试剂盒检测颗粒细胞培养24h的培养液中类固醇激素的水平,结果发现SMAD7过表达组中细胞培养液的孕酮水平极显著高于NC组（P＜0.01）,SMAD7过表达组的雌二醇水平显著低于NC组（P＜0.01）。siRNA-SMAD7组中细胞培养液的孕酮水平极显著低于siRNA-control组（P＜0.01）,siRNA-SMAD7组中雌二醇水平极显著高于siRNA-control组（P＜0.01）。结果表明,SMAD7能够调控颗粒细胞中孕酮和雌二醇的分泌,进而调节卵泡的发育进程。5.SMAD7过表达或干扰后,检测TGF-β/SMAD信号通路中关键基因SMAD2/3/4的表达,结果发现SMAD7过表达抑制SMAD2/3的m RNA和蛋白表达（P＜0.01）,但对SMAD4没有明显的影响（P＞0.05）。SMAD7干扰则促进SMAD2/3的m RNA和蛋白表达（P＜0.05）,但对SMAD4没有明显的影响（P＞0.05）。结果表明,在卵巢颗粒细胞中SMAD7主要通过抑制SMAD2/3的表达来抑制TGF-β/SMAD信号通路的传导。综上所述,本研究证明了:（1）SMAD7抑制山羊卵巢颗粒细胞的增殖,促进细胞凋亡;（2）SMAD7抑制山羊颗粒细胞分泌雌二醇、促进孕酮的合成;（3）在山羊颗粒细胞中,SMAD7可以通过抑制SMAD2/3的表达来抑制TGF-β/SMAD通路的信号传导。本研究结果表明,SMAD7可能通过影响颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素分泌,进而调节卵泡的发育与闭锁。
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