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目的自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是一种发病原因尚不明确的肝脏慢性炎症性疾病,以女性患者居多,主要特点为:血清转氨酶和免疫球蛋白不同程度升高,血清自身抗体阳性。由于每种自身免疫性肝病特征不同,产生的自身抗体不一,因此,对AIH患者血清自身抗体的检测十分重要。本课题旨在表达AIH的6种蛋白抗原,将其制成膜条,并联合量子点标记的二抗对AIH自身抗体进行检测。目前表达蛋白的体系有很多,包括原核表达系统、真核表达系统、无细胞表达系统以及其他表达系统,其中比较常用的是原核和真核表达系统,由于外源蛋白在原核宿主内重组表达时缺乏转录后修饰如糖基化和磷酸化作用,大分子质量蛋白很难用细菌表达系统成功表达,且在蛋白表达的过程中很有可能形成包涵体,而真核表达系统可以避免这些不足。因此,本研究采用真核表达系统中常用的昆虫杆状病毒表达系统对AIH相关的蛋白抗原AMA,GP210,SP100,LC-1,LKM-1,SLA/LP进行表达。目前,常用的检测AIH自身抗体的方法有间接免疫荧光法、免疫印迹法、酶联免疫吸附法和化学发光法等。但这些方法存在一定不足:间接免疫荧光法人工操作较复杂,影响因素较多且主观性比较强;免疫印迹法和酶联免疫吸附法的检测抗体是酶标物,生成物显色不稳定,无法进行长时间观察;化学发光法的检测抗体常用化学发光剂吖啶酯(acridinium ester,AE)进行标记,生成物发光不稳定,易受环境因素影响等。而量子点是一种新兴的荧光标记物,发光较稳定,可反复成像,且操作步骤简单,检测快速,在紫外灯下即可进行结果观察。因此,本实验将成功表达的蛋白抗原制成膜条,对该检测体系进行优化后,分别检测40例AIH阳性患者和40例健康人的临床血清,加入量子点标记的羊抗人IgG,紫外灯下观察结果,以间接免疫荧光和免疫印迹法做对照,比较量子点标记免疫印迹与间接免疫荧光、免疫印迹法的符合率。方法1.基因克隆:对购买的含有目的基因AMA,GP210,SP100,LC-1,LKM-1,SLA/LP的质粒进行PCR,琼脂糖凝胶电泳,胶回收以及DNA产物纯化,通过酶切验证目的基因成功连接到昆虫细胞表达载体p Fast HTA上后,用感受态细胞DH5α扩大培养然后转化进DH10 Bac大肠杆菌中,提取杆粒,PCR后跑琼脂糖凝胶电泳验证杆粒提取成功。2.蛋白表达:培养SF9昆虫细胞,将提取成功的杆粒转染进SF9昆虫细胞,获得第一代病毒(P1),通过反复感染获得第二代病毒(P2),第三代病毒(P3),用Q-PCR的方法计算P3的病毒滴度,将适量的高病毒滴度的P3加入悬浮培养的SF9昆虫细胞中,培养72小时,通过超声破碎将细胞中的目的蛋白AMA,GP210,SP100,LC-1,LKM-1,SLA/LP释放出来。3.蛋白纯化:将含有目的抗原蛋白AMA,GP210,SP100,LC-1,LKM-1,SLA/LP的混合蛋白用镍柱(Ni柱)及不同浓度的咪唑进行纯化,然后用透析的方法将纯化好的蛋白中的咪唑置换出来,并用BCA法检测目的蛋白的浓度。4.阳性标本的检测:已纯化好的目的蛋白由亚辉龙生物科技有限公司制成膜条,对该检测体系进行优化后,分别检测40例AIH阳性患者和40例健康人的临床血清,加入量子点标记的羊抗人IgG,紫外灯下观察结果,以间接免疫荧光和免疫印迹做对照,比较它们的符合率。结果1.成功扩增出了AMA,GP210,SP100,LC-1,LKM-1,SLA/LP的基因片段,经过酶切鉴定已经成功连接到pFastHTA载体上;经PCR验证已成功提取到6个目的基因对应的杆粒。2.SF9昆虫细胞成功表达AMA,GP210,SP100,LC-1,LKM-1,SLA/LP 6种抗原蛋白,SDS-PAGE、Western Blotting结果表明重组目的蛋白经过亲和层析被很好的纯化,且与预期蛋白分子的大小一致,抗原性良好。3.经过一系列反应条件的优化,确定量子点标记的二抗浓度1:100稀释,阳性混合血清1:100稀释,反应时间为15min时可以达到一个较佳的检测水平;量子点标记的免疫印迹法对AIH自身抗体的检测结果与间接免疫荧光和免疫印迹方法相比,阳性符合率为90%,阴性符合率为92.5%,总体符合率为91.25%。结论量子点标记的免疫印记法检测AIH相关自身抗体与间接免疫荧光和免疫印迹方法相比具有较好的符合性,该方法操作简单,检测快速,耗时短,结果稳定且易于判断。