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目的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)是基于基因工程构造并表达于细胞表面的受体蛋白,由抗原识别区(single chain variable fragment,ScFv)、铰链区、跨膜区和胞内信号转导区组成。通过病毒感染或电转等方式使嵌合抗原受体表达在T细胞表面从而构建成CAR-T细胞。CAR-T细胞治疗是近年来兴起的一种新的癌症治疗手段,也是当前抗肿瘤免疫治疗中的研究热点。嵌合抗原受体T细胞不受HLA分子限制,可以直接识别肿瘤细胞表面抗原发挥杀伤功能,在对晚期难治性白血病与淋巴瘤的治疗中都取得了显著的治疗效果。然而,CAR-T细胞在实体瘤治疗中仍存在诸多障碍,例如,如何使CAR-T细胞穿过组织屏障更多的向肿瘤部位聚集;到达肿瘤部位CAR-T细胞如何浸润至肿瘤内部并克服肿瘤免疫抑制微环境的影响从而更加有效地杀伤肿瘤细胞等。另外,CAR-T细胞治疗的安全性问题也不容忽视:一方面CAR-T细胞大多靶向肿瘤相关抗原,而这些抗原在正常组织中通常有微量表达,易产生脱靶效应;另一方面CAR-T细胞在体内会产生大量细胞因子易引起细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS),产生高热、乏力、肌痛、心动过速及毛细血管渗漏等症状,严重时可引起肾损害及肝功能衰竭而威及生命。NK细胞作为天然免疫系统重要的一员,被视为同样有潜力通过CAR修饰增强其抗肿瘤能力的效应细胞。NK细胞与T细胞相比有以下几个优点:(1)NK细胞属于人体天然免疫系统,无需抗原致敏就可产生即刻杀伤作用;(2)NK细胞转输入人体后不会引起移植物抗宿主病;(3)NK细胞在体内的存活期短,不会产生大量的TNF-α等炎症因子,因此,不会像CAR-T细胞一样引起严重的细胞因子风暴;(4)CAR-NK细胞不仅仅依靠单链抗体识别肿瘤抗原介导对肿瘤的抗原特异性杀伤,而且可通过NK细胞表面的活化受体(如NKG2D、NKp46、NKp30等)识别肿瘤细胞上相应的配体介导NK细胞的活化和对肿瘤的杀伤,还可通过ADCC效应介导对肿瘤的杀伤;(5)NK细胞有多种来源,如外周血、脐带血、胚胎干细胞、诱导多能造血干细胞以及NK细胞系(如NK-92)等。由于同种异体转输NK细胞不会引起移植物抗宿主病,因此CAR-NK细胞相比于CAR-T细胞更易制备成即用型产品用于癌症的免疫治疗。间皮素(Mesothelin)因其在间皮细胞(包括胸膜间皮细胞、心包膜、腹膜等)的表达而得名。通过免疫组织化学和基因表达检测发现,间皮素在几乎100%的胰腺癌组织和细胞系中高表达,而在正常胰腺组织中几乎不表达。间皮素在正常间皮细胞中的作用尚不明确,有猜测称其可能与细胞间的粘附相关,而间皮素异常表达可促进癌细胞增殖,并在肿瘤的恶性转化和侵袭性方面发挥积极作用。本研究以间皮素为靶点,首先将靶向间皮素的CAR基因片段构建到睡美人转座子上,然后通过电转化得方式将载体导入NK-92细胞,使CAR分子表达在NK-92细胞表面,从而构建成靶向间皮素的CAR-NK-92(MLSN CAR-NK-92)细胞系。接着通过体内外实验验证CAR-NK-92对胰腺癌的治疗效果。在这些研究基础上,我们又构建了同时含有靶向间皮素CAR和趋化因子受体基因片段的慢病毒载体,然后将载体进行慢病毒包装,用得到的病毒液感染NK-92细胞从而构建成同时表达靶向间皮素CAR和过表达趋化因子受体的NK-92细胞系(MLSN CAR-CXCR2-NK-92、MLSN CAR-CXCR6-NK-92)。最后通过实验验证同时表达靶向间皮素CAR和过表达趋化因子受体的NK-92细胞的趋化能力及对胰腺癌的治疗作用。方法1.qPCR检测不同肿瘤细胞间皮素的表达。2.通过PCR扩增靶向间皮素的CAR基因片段,将其构建到pSBbi-GP载体上。3.靶向间皮素的CAR载体电转NK-92细胞,经嘌吟霉素筛选后获得MLSN CAR-NK-92 细胞系。4.通过LDH法和艾森活细胞检测仪检测MLSN CAR-NK-92细胞对胰腺癌细胞的杀伤作用。5.通过流式细胞术检测MLSN CAR-NK-92细胞与胰腺癌细胞共培养后杀伤效应分子和细胞因子表达情况。6.ELISA检测MLSN CAR-NK-92细胞与胰腺癌细胞共培养后细胞因子的分泌情况。7.建立裸鼠胰腺癌异种移植模型,验证MLSN CAR-NK-92细胞对胰腺癌的治疗作用。8.通过H&E染色检测胰腺癌肿瘤组织中淋巴细胞浸润情况。9.通过免疫组化和免疫荧光检测胰腺癌肿瘤中NK细胞的浸润情况。10.通过Masson染色检测胰腺癌肿瘤组织胶原纤维表达情况。11.qPCR检测胰腺癌细胞趋化因子的表达。12.构建 pLent-MLSN CAR-GFP、pLent-MLSN CAR-P2A-CXCR2-GFP 及pLent-MLSN CAR-P2A-CXCR6-GFP 慢病毒载体。13.慢病毒包装 pLent-MLSN CAR-GFP、pLent-MLSN CAR-P2A-CXCR2-GFP 及pLent-MLSN CAR-P2A-CXCR6-GFP 载体。14.慢病毒感染NK-92细胞并通过流式细胞术分选得到MLSN CAR-NK-92、MLSN CAR-CXCR2-NK-92 及 MLSN CAR-CXCR6-NK-92 细胞系。15.检测 MLSN CAR-CXCR2-NK-92 和 MLSN CAR-CXCR6-NK-92 细胞向胰腺癌细胞的趋化能力。16.检测同时表达靶向间皮素CAR和过表达趋化因子受体的NK-92细胞细胞体外对胰腺癌细胞的杀伤作用。17.建立裸鼠胰腺癌异种移植模型,验证MLSN CAR-CXCR2-NK-92细胞对胰腺癌的治疗作用。结果1.胰腺癌细胞Capan-2高表达间皮素。2.pSBbi-GP-MSLN CAR 载体构建成功。3.pSBbi-GP-MSLN CAR载体电转NK-92细胞并经嘌呤霉素筛选后得到MSLN CAR-NK-92 细胞系。4.MLSN CAR-NK-92细胞对胰腺癌细胞Capan-2的杀伤效率明显高于NK-92细胞。5.MLSN CAR-NK-92细胞与胰腺癌细胞共培养后杀伤效应分子CD107a、Granzyme B和perforin以及细胞因子IFN-γ和TNF-α表达水平均高于NK-92细胞。6.MLSN CAR-NK-92细胞与胰腺癌细胞共培养后细胞因子IFN-γ和TNF-α分泌水平高于NK-92细胞。7.MLSN CAR-NK-92细胞较NK-92细胞抑制肿瘤生长的效果更明显。8.MLSN CAR-NK-92细胞较NK-92细胞肿瘤内浸润数量更多。9.胰腺癌肿瘤组织中含有丰富的胶原纤维。10.胰腺癌细胞Capan-2高表达趋化因子CXCL8和CXCL16,CXCL8表达更高。11.pLent-MLSN CAR-GFP、pLent-MLSN CAR-P2A-CXCR2-GFP 及 pLent-MLSN CAR-P2A-CXCR6-GFP慢病毒载体构建成功。12.pLent-MLSN CAR-GFP、pLent-MLSN CAR-P2A-CXCR2-GFP、pLent-MLSN CAR-P2A-CXCR6-GFP载体的慢病毒包装成功。13.慢病毒感染NK-92细胞并经流式细胞术分选后获得MLSN CAR-NK-92、MLSN CAR-CXCR2-NK-92 及 MLSN CAR-CXCR6-NK-92 细胞系。14.MLSN CAR-CXCR2-NK-92细胞向胰腺癌细胞的趋化能力明显高于MLSN CAR-CXCR6-NK-92、MLSN CAR-NK-92 和 NK-92 细胞。15.MLSN CAR-CXCR2-NK-92与MLSN CAR-NK-92细胞相比对胰腺癌细胞的体外杀伤作用没有明显差异。16.对胰腺癌异种移植小鼠治疗3天后MLSN CAR-CXCR2-NK-92细胞抑瘤效果略好于MLSN CAR-NK-92细胞,明显好于NK-92细胞。结论1.成功构建了靶向间皮素的MLSN CAR-NK-92细胞系。2.MLSN CAR-NK-92细胞与NK-92细胞相比抑制胰腺癌肿瘤生长效果更明显。3.成功构建了同时表达靶向间皮素CAR及过表达趋化因子受体的NK-92细胞系(MLSN CAR-CXCR2-NK-92 和 MLSN CAR-CXCR6-NK-92)。4.MLSN CAR-CXCR2-NK-92 细胞相比于 MLSN CAR-CXCR6-NK-92 和 MLSN CAR-NK-92细胞向胰腺癌细胞的趋化能力更强。