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纤维素、半纤维素是自然界最丰富的可再生资源之一。地球每年由光合作用产生数亿吨的植物干物质,其主要成分就是纤维素和半纤维素。纤维素、半纤维素的充分利用及有效的转化对于解决当前的能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有重大意义。目前,纤维素和半纤维素的酶学降解是公认最有效、最清洁的转化方法。多功能纤维素酶基因mfc是从福寿螺(Ampullaria crossean)胃组织细胞中克隆获得。其表达产物具有葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶以及内切-β-1,4-木聚糖酶等多种酶活力。
银耳(Tremella fuciformis)是一种腐生真菌,其营养生长阶段具有两种营养体形态——酵母状分生孢子(即芽孢)和菌丝。银耳芽孢兼具了原核生物和低等真核生物酵母的特点如易生长、繁殖速度快、可进行高密度发酵等,以及高等真核生物分化发育过程。此外,银耳芽孢具有很强的外源蛋白分泌能力,以其作为受体菌表达外源蛋白将更安全、产物也更易于纯化。
本研究以银耳为受体菌株,首次将动物来源的多功能纤维素酶基因mfc遗传转化银耳芽孢,经PCR、Southern杂交鉴定证实成功获得转化子。主要结果如下:
(1)以灵芝gpd-G1启动子、香菇gpd-Lel启动子构建了两个多功能纤维素酶基因表达载体pgGl-mfc、pgLel-mfc。
(2)采用电击法和醋酸锂法,将含有潮霉素抗性基因hph的表达载体pBgGl-hph分别与三个含有多功能纤维素酶基因的表达载体pgGl-mfc、pgLel-mfc、pgLes-mfc共转化银耳芽孢,经潮霉素抗性筛选获得假定转化子。
(3)随机挑选的部分假定转化子经PCR、Southern杂交鉴定证实所构建的三个多功能纤维素酶基因表达载体pgGl-mfc、pgLel-mfc、pgLes-mfc其mfc基因均己成功整合到银耳芽孢基因组DNA中:ycLes-2、ycLes-3、ycLes-4、ycLes-5、ycLes-9为含有香菇gpd-Les启动子的转化子;ycGl-2、ycGl-3为含有灵芝gpd-G1启动子的转化子;vcLel-3、ycLel-4、ycLel-7为含有香菇gpd-Lel启动子的转化子。
(4)对10个银耳芽孢转化子分别进行滤纸水解活力的测定、羧甲基纤维素钠水解活力的测定及Oat spelt木聚糖水解活力的测定,结果显示:ycLes-4的滤纸酶活最高,为24.61U/InL,是对照(8.19U/mL)的2.94倍;ycLes-3的CMC酶活最高,为27.32U/mL,是对照(17.80U/mL)的1.53倍;ycLes-3的木聚糖酶活最高,为140.43U/mL,是对照(3.74U/mL)的37.55倍。