喉癌是耳鼻喉科最常见的恶性肿瘤之一,其主要病理类型为喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）。根据其原发部位的不同,主要分为声门型、声门上型和声门下型喉癌,声门型喉癌最为常见。2018年,全世界喉癌的新发病例是177,422例,约占总的全身恶性肿瘤新发病例的1%左右,其导致的死亡病例为94,771例,且近年来,全球的喉癌发病率在逐年上升。随着人们对生活质量要求的不断提升和科学技术的发展,人们对于喉功能保留、重建有了更高的向往与追求,喉癌的治疗方案也在不断的丰富和改进。然而,最新的调查显示喉癌患者的总体生存率并没有得到明显提升,甚至有下降的趋势,晚期喉癌的预后仍不甚理想。临床上,复发和转移成为限制喉癌患者预后的主要因素,大约有60%的患者在确诊时已经到了晚期。因此,探讨研究喉鳞状细胞癌发生发展的分子机制已尤为重要。近些年来,随着科学技术的不断发展,研究人员发现在人类的RNA中只有不到2%的RNA能够进行编码蛋白质,多数RNA难以编码蛋白质,这类不能编码蛋白质的基因称为非编码RNA（non-codingRNA,ncRNA）。长链非编码RNA（long non-codingRNA,lncRNA）是非编码RNA的一类,它的长度大于200个核苷酸,它能在转录调控层面及转录后调控层面参与调控肿瘤的发生与发展,同时它与肿瘤的浸润及转移等密切相关。本研究通过对表达谱基因芯片进行分析,筛选出了LSCC组织与其临近正常组织中具有差异性表达的lncRNAs,其中lncRNA RASSF8-AS1在喉癌组织中表达显著下调,这引起了我们的关注。微小RNA（microRNA,miRNA）是一类含有18-25个核苷酸的的非编码RNA,它可以通过与它的靶向mRNA分子的3’UTR（3’untranslated region,3’非编码区）特异性的结合,抑制mRNA的合成或直接将其降解掉,在转录以及转录后水平参与基因的调控。近些年,lncRNA与miRNA相互作用的研究备受关注,特別是竞争性内源RNA（competitive endogenousRNA,ceRNA）机制尤其成为人们现在研究的热点问题,为阐明两者之间的关系提供了一种新的思路。IncRNA能够作为ceRNA分子,竞争性的结合特定的某个或多个miRNA,从而减少miRNA对其下游靶基因的调控作用。本实验旨在探讨RASSF8-AS1通过竞争性结合miR-664b-3p,进而调节I型分裂蛋白转导素样增强子（Transducin-like enhancer of split 1,TLE1）的表达,从而影响喉鳞状细胞癌的恶性生物学行为,这样的一种分子机制。主要研究内容和结果如下:第一部分RASSF8-AS1的筛选及其在喉鳞状细胞癌中的表达情况目的:运用表达谱基因芯片分析技术,筛选出LSCC癌组织与其临近正常组织中表达具有差异性的lncRNAs,选取表达下调的lncRNA RASSF8-AS1作为研究对象,分析RASSF8-AS1在喉鳞状细胞癌组织及细胞中的表达水平,并分析其表达水平与LSCC患者临床病理特征是否存在相关性。方法:1.对4例LSCC患者的喉癌组织及其对应的临近正常组织进行表达谱芯片检测,筛选出差异表达的lncRNAs。2.采用荧光定量反转录聚合酶链反应（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR）技术检测RASSF8-AS1在72例LSCC患者癌组织及其对应的临近正常组织中的差异性表达情况。3.采用q RT-PCR技术检测RASSF8-AS1在4株LSCC细胞系TU686、TU177、TU212以及AMC-HN-8以及正常对照组中的差异性表达情况。4.通过基因表达谱相互作用分析网站（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）分析RASSF8-AS1在多种肿瘤组织及其正常对照组中的差异性表达情况。5.对RASSF8-AS1在喉癌患者组织中的的相对表达量与其临床病理学特征,如TNM临床分期、病理分化程度、颈部淋巴结有无转移、年龄、吸烟以及饮酒等进行相关性分析。结果:1.表达谱芯片分析技术筛选出（Fold change≥2）3073个差异表达的lncRNA,这其中有1967个lncRNA在LSCC组织中表达上调,有1106个在LSCC组织中表达下调。2.从上述差异基因中选择RASSF8-AS1作为研究对象,q RT-PCR结果显示在72例喉鳞状细胞癌患者癌组织中RASSF8-AS1的相对表达量显著低于其相对应的临近正常组织。（t=5.615,P<0.01）。3.RASSF8-AS1在TU686细胞系中的相对表达量显著低于正常对照组（P<0.01）,同样在TU177细胞（P<0.01）、TU212细胞（P<0.01）以及AMC-HN-8细胞中（P<0.01）也得出相同结果。4.GEPIA分析结果显示:RASSF8-AS1在多种肿瘤瘤组织中的表达量较正常组织中的显著降低。5.RASSF8-AS1在LSCC癌组织中的表达量与LSCC患者的TNM临床分期、病理分化程度和颈部淋巴结转移密切相关,其在低分化组、伴有淋巴结转移组以及TNM分期的Ⅲ、Ⅳ期组中呈现低表达（P<0.05）,而与患者的年龄、有无饮酒及吸烟无明显相关性（P>0.05）。第二部分RASSF8-AS1对喉鳞状细胞癌细胞生物学功能的影响目的:通过体外实验,探讨RASSF8-AS1对喉鳞状细胞癌细胞生物学功能的影响。方法:1.构建RASSF8-AS1的过表达载体pc DNA3.1-RASSF8-AS1,并将其与空载质粒pc DNA3.1分别转染LSCC细胞系TU686和TU177细胞中去,并采用q RT-PCR的方法检测过表达效率。2.在体外细胞实验中,设置pc DNA3.1-RASSF8-AS1以及pc DNA3.1两组,采用Transwell小室迁移、侵袭实验来验证以上两组对LSCC癌细胞迁移以及侵袭能力影响。3.在体外细胞实验中,设置pc DNA3.1-RASSF8-AS1以及pc DNA3.1两组,采用MTS以及克隆形成实验验证以上两组对LSCC癌细胞增殖能力影响。结果:1.LSCC细胞系TU686和TU177分别转染过表达质粒pc DNA3.1-RASSF8-AS1或空载pc DNA3.1后,利用q RT-PCR检测,目的基因表达量明显高于空载质粒组（P<0.01）,过表达RASSF8-AS1的细胞株建立完成。2.体外细胞实验:Transwell小室迁移以及侵袭实验证明转染pc DNA3.1-RASSF8-AS1后LSCC细胞系TU686和TU177细胞的迁移以及侵袭能力均较转染pc DNA3.1组显著降低,且结果有统计学差异（P<0.01）。3.体外细胞实验:MTS以及细胞克隆实验证明转染pc DNA3.1-RASSF8-AS1后LSCC细胞系TU686和TU177细胞的增殖能力均较转染pc DNA3.1组显著降低,且结果有统计学差异（P<0.01）。第三部分RASSF8-AS1靶向miRNA的选择、鉴定及miR-664b-3p对喉鳞状细胞癌细胞生物学功能的影响目的:探讨RASSF8-AS1与靶向miRNA（miR-664b-3p）之间的调控关系,以及miR-664b-3p对LSCC细胞生物学功能的影响。方法:1.利用细胞浆、核RNA分离试剂盒,分别提取LSCC细胞系AMC-HN-8、TU177、TU212以及TU686的细胞核以及细胞浆RNA,用q RT-PCR的技术方法检测RASSF8-AS1的亚细胞定位。2.通过生物学信息预测软件Target Scan（http://www.targetscan.org/）以及DIANA（http://www.microrna.gr/micro TCDS）预测RASSF8-AS1的靶向miRNA,并确定其结合位点。3.构建pmir GLO-RASSF8-AS1-WT和pmir GLO-RASSF8-AS1-MUT型质粒,应用双荧光素酶报告基因实验在TU177细胞及工具细胞293T中验证RASSF8-AS1与miR-664b-3p两者之间的靶向结合关系。4.在喉癌细胞系TU177中应用基于MS2结合序列-MS2结合蛋白（MS2bs-MS2bp）的RNA免疫共沉淀技术（RIP）进一步验证RASSF8-AS1与miR-664b-3p之间的结合关系。5.通过q RT-PCR的技术方法检测在LSCC细胞系TU686以及TU177中分别转染pc DNA3.1-RASSF8-AS1以及pc DNA3.1后miR-664b-3p表达量的变化情况。6.应用Pearson方法对72例喉癌患者癌组织中RASSF8-AS1以及miR-664b-3p的相对表达量进行相关性分析。7.通过q RT-PCR的技术方法验证miR-664b-3p在72例LSCC患者癌组织及其相对应的临近正常组织中的表达量的差异性情况。8.合成miR-664b-3p的类似物miR-664b-3p-mimic及抑制物miR-664b-3p-inhibitor,并将它们分别转染到LSCC细胞系TU686和TU177中,采用q RT-PCR的技术方法检测miR-664b-3p的表达量。9.采用Transwell小室迁移、侵袭实验验证上调及下调miR-664b-3p后对LSCC癌细胞迁移以及侵袭能力的影响。采用MTS以及克隆形成实验验证上调及下调miR-664b-3p后对LSCC癌细胞增殖能力的影响。10.采用Transwell小室迁移、侵袭实验以及MTS实验、克隆形成实验检测LSCC细胞系TU686及TU77中转染miR-664b-3p-mimic,及共转染miR-664b-3p-mimic+pc DNA3.1-RASSF8-AS1后对LSCC细胞迁移、侵袭以及增殖能力的影响。结果:1.RASSF8-AS1在TU177、TU686、TU212以及AMC-HN-8,4株喉癌细胞系的细胞核、浆中都有表达,在浆中的表达量略多于核中。2.通过生物信息学预测显示miR-664b-3p与RASSF8-AS1具有潜在的结合位点,并分析出其结合位点。3.双荧光素酶报告基因实验结果显示在TU177细胞及工具细胞293T中与共转染NC质粒比较,共转染pmir GLO-RASSF8-AS1-WT质粒及miR-664b-3p-mimic可显著降低荧光素酶的活性（P<0.01）,与此相反,共转染了pmir GLO-RASSF8-AS1-WT型质粒和miR-664b-3p-inhibitor之后荧光素酶的活性得到了明显增强（P<0.01）,当对pmir GLO-RASSF8-AS1-WT进行突变后,各组的荧光素酶活性没有明显变化（P>0.05）。4.RNA免疫共沉淀技术（RIP）实验结果显示,转染了pc DNA3.1-RASSF8-AS1-MS2（12x）质粒组所富集的miR-664b-3p含量显著高于转染pc DNA3.1-RASSF8-AS1-MS2（12x）-MUT质粒组,两者之间的q RT-PCR结果具有统计学差异（P<0.01）。5.q RT-PCR结果显示,在LSCC细胞系TU686以及TU177中分别转染pc DNA3.1-RASSF8-AS1及pc DNA3.1后对miR-664b-3p的表达量进行比较,发现过表达RASSF8-AS1后与对照组相比miR-664b-3p的表达明显降低,结果具有统计学差异（P<0.01）。6.Pearson统计分析结果显示在72例喉癌患者癌组织中RASSF8-AS1与miR-664b-3p的相对表达量密切相关,且两者成负相关（r=-0.5099,P<0.01）。7.miR-664b-3p在72例喉鳞状细胞癌患者癌组织中的表达量显著高于其相对应的临近正常组织。（t=4.542,P<0.01）。8.q RT-PCR结果显示,转染miR-664b-3p-mimic可有效上调miR-664b-3p在LSCC细胞系TU686及TU177中的表达水平,而在转染miR-664b-3p-inhibitor可显著下调miR-664b-3p在LSCC细胞系TU686及TU177中的表达水平（P<0.01）。9.体外实验证实,过表达miR-664b-3p可显著促进LSCC细胞系TU686及TU177的迁移、侵袭以及增殖的能力（P<0.01）,下调miR-664b-3p可明显抑制TU686及TU177细胞的迁移、侵袭以及增殖的能力（P<0.01）。10.在TU686及TU177细胞中,共转染RASSF8-AS1后部分逆转了过表达miR-664b-3p对TU686及TU177细胞的迁移、侵袭以及增殖能力的促进作用。（P<0.01）第四部分miR-664b-3p在喉鳞癌中靶向调控的mRNA筛选、鉴定以及TLE1对喉鳞状细胞癌细胞生物学功能的影响目的:探讨miR-664b-3p与其靶向mRNA:TLE1两者之间的调控关系,以及TLE1对LSCC细胞生物学功能的影响。方法:1.通过生物学信息预测软件Target Scan（http://www.targetscan.org/）以及DIANA（http://www.microrna.gr/micro TCDS）预测miR-664b-3p的靶向mRNA,并确定其结合位点。2.分别转染miR-664b-3p-mimic以及miR-664b-3p-inhibitor到LSCC细胞系TU686和TU177中,采用q RT-PCR的技术方法检测上调以及下调miR-664b-3p后TLE1在mRNA水平表达量的变化情况。3.分别转染miR-664b-3p-mimic以及miR-664b-3p-inhibitor到LSCC细胞系TU686和TU177中,采用western blot的方法检测上调以及下调miR-664b-3p后TLE1的蛋白水平的变化情况。4.采用q RT-PCR技术检测TLE1在72例LSCC患者癌组织及其对应的临近正常组织中的表达情况。5.应用Pearson相关统计方法对72例喉癌患者癌组织中TLE1以及miR-664b-3p的相对表达量进行相关性分析。6.构建pmir GLO-TLE1-WT以及pmir GLO-TLE1-MUT型质粒,在TU177细胞及293T细胞中,应用双荧光素酶报告基因实验对TLE1以及miR-664b-3p两者之间的结合关系进行验证。7.通过q RT-PCR的技术方法验证上调RASSF8-AS1后TLE1在LSCC细胞系TU686及TU177细胞中的表达量的变化。8.分别转染pc DNA3.1-RASSF8-AS1以及pc DNA3.1到LSCC细胞系TU686和TU177中,采用western blot的技术方法检测上调RASSF8-AS1后TLE1的蛋白水平的变化情况。9.采用Transwell小室迁移、侵袭实验以及MTS实验、克隆形成实验检测LSCC细胞系TU686及TU77中转染pc DNA3.1-RASSF8-AS1,及共转染sh-TLE1+pc DNA3.1-RASSF8-AS1后对LSCC细胞迁移、侵袭以及增殖能力的影响。结果:1.通过生物信息学预测显示miR-664b-3p与TLE1具有潜在的结合位点,并分析出其结合位点。2.q RT-PCR结果显示,在LSCC细胞系TU686以及TU177中分别转染miR-664b-3p-mimic及miR-664b-3p-inhibitor后对TLE1的表达量进行比较,发现上调miR-664b-3p后与正常对照组相比TLE1的表达明显下降,而下调miR-664b-3p后,TLE1的表达明显增加,且结果具有统计学差异（P<0.01）。3.Western blot结果显示,在LSCC细胞系TU686以及TU177中分别转染miR-664b-3p-mimic及miR-664b-3p-inhibitor后对TLE1的蛋白表达量进行比较,发现过上调miR-664b-3p后与正常对照组相比TLE1的蛋白表达水平明显下降,而下调miR-664b-3p后TLE1的蛋白量水平明显增加,且结果具有统计学差异（P<0.01）。4.TLE1在72例喉鳞状细胞癌患者癌组织中的表达量显著低于其相对应的临近正常组织（t=5.345,P<0.01）。5.Pearson统计分析结果显示在72例喉癌患者癌组织中TLE1与miR-664b-3p的相对表达量密切相关,且两者成负相关（r=-0.4906,P<0.01）。6.双荧光素酶报告基因实验结果显示在TU177细胞及293T细胞中,与共转染NC质粒比较,共转染pmir GLO-TLE1-WT质粒及miR-664b-3p-mimic可显著降低荧光素酶的活性（P<0.01）,与此相反,共转染了pmir GLO-TLE1-WT型质粒和miR-664b-3p-inhibitor之后荧光素酶的活性得到了明显增强（P<0.01）,当对pmir GLO-TLE1-WT进行突变后,各组的荧光素酶活性没有明显变化（P>0.05）。7.q RT-PCR结果显示:分别pc DNA3.1-RASSF8-AS1及pc DNA3.1到LSCC细胞系TU686及TU177中去,发现转染pc DNA3.1-RASSF8-AS1后可显著上调LSCC细胞系TU686及TU177中TLE1的mRNA水平的表达,且结果具有统计学差异（P<0.01）。8.Western blot结果显示:将pc DNA3.1-RASSF8-AS1及pc DNA3.1分别转染到TU686及TU177细胞中去,转染pc DNA3.1-RASSF8-AS1后可显著提高LSCC细胞系TU686及TU177中TLE1的蛋白表达水平,且结果具有统计学差异（P<0.01）。9.在TU686及TU177细胞中,共转染sh-TLE1后部分逆转了pc DNA3.1-RASSF8-AS1对TU686及TU177细胞的迁移、侵袭以及增殖能力的抑制作用。结论:1.在喉鳞状细胞癌组织以及细胞中,RASSF8-AS1表达显著下调,且RASSF8-AS1在癌组织中的表达量与LSCC患者的TNM临床分期、病理分化程度和颈部淋巴结转移密切相关。2.过表达RASSF8-AS1可以抑制LSCC细胞的迁移、侵袭以及增殖能力,这提示RASSF8-AS1参与了喉鳞癌的进展过程。3.RASSF8-AS1与miR-664b-3p在LSCC中的表达呈负相关性,且过表达RASSF8-AS1会减弱miR-664b-3p的促癌作用。4.RASSF8-AS1通过miR-664b-3p调控TLE1的表达,进而抑制LSCC细胞的体外迁移、侵袭以及增殖的能力。