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背景肝移植是目前治疗各种终末期肝病的唯一有效的手段。然而,供肝来源的缺乏仍然是限制临床肝移植开展的重要因素。目前,随着人口老龄化日趋严重,肝移植供体的年龄呈现增高趋势,老龄供肝已经成为一种重要的供肝来源。虽然老龄供肝的应用获得了初步认可,但探讨老龄供肝的术后管理,尤其是免疫耐受的维持,仍是临床肝移植手术亟待解决的难题。库普弗细胞（Kupffer cells,KCs）是体内最大的巨噬细胞群,也是肝内主要的吞噬细胞,其吞噬凋亡细胞后,由M1型向M2型偏移是诱导肝移植免疫耐受形成的重要机制,并且与细胞内钙离子浓度变化有关,这提示,钙离子流动改变可能是连接胞葬作用和细胞极性偏移的关键桥梁。新近研究发现,GPR37能够正性调节吞噬细胞的胞葬作用,同时影响巨噬细胞内钙离子浓度,但以细胞实验为主,尚未涉及肝移植免疫耐受方面,具体机制仍需进一步研究。因此,深入研究GPR37介导的胞葬作用在KCs M2极化中的作用,明确KCs在吞噬凋亡细胞后引起自身细胞极性向M2型偏移的机制,对于诱导老龄供肝肝移植后免疫耐受的形成有着重要的临床意义。第一部分过表达GPR37对老龄鼠供肝肝移植免疫耐受微环境形成的作用目的:经门静脉转染CD68标记的腺相关病毒,观察过表达GPR37对老龄大鼠肝移植后肝脏急性排斥反应程度、凋亡细胞清除能力、肝内KCs M2型极化水平等免疫耐受微环境指标的影响。方法:（1）根据改良后的“双袖套法”,以雄性Lewis大鼠为供体、雄性BN大鼠为受体,建立大鼠肝移植急性排斥模型;（2）按照供肝情况,随机分为4组（n=30只/组）:对照组（Ctrl group）;老龄供肝组（Aged group）;老龄对照组（AAV-Ctrl group）;GPR37过表达组（AAV-OE group）;（3）各组随机选择10只大鼠,用于肝脏和血液标本收集;10只用于组织蛋白提取;10只用于KCs的分离、培养;（4）运用Western blot,检测各组肝组织内、KCs中GPR37的表达水平;（5）运用免疫组化染色,检测各组肝组织内GPR37的表达水平;（6）运用免疫荧光染色,检测各组KCs中GPR37的表达;（7）运用HE染色法,检测各组大鼠肝组织病理改变,并对肝移植后急性排斥反应进行评分;（8）运用全自动生化仪检测各组大鼠血清ALT、AST水平,对各组大鼠肝功能改变进行评估;（9）运用TUNEL染色,检测各组大鼠肝组织内凋亡细胞数量,以评估肝组织凋亡细胞清除能力;（10）运用免疫组化检测各组大鼠肝组织内CD163、i NOS阳性的KCs数量,以评估各组肝组织内KCs极化状态;（11）运用ELISA、RT-PCR检测各组大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-10的表达水平,以评估炎症因子分泌谱改变;（12）给予细胞松弛素D处理后,运用TUNEL染色、免疫组化染色,检测各组肝组织内凋亡细胞数量、CD163、i NOS阳性的KCs数量,以评估GPR37介导的凋亡清除对KCs M2型极化的影响。结果:（1）Western blot结果显示,较对照组相比,老龄供肝组肝组织内GPR37表达显著下降;老龄供肝组供肝KCs内GPR37表达显著下降;（2）免疫组化结果显示,较对照组相比,老龄供肝组肝组织内GPR37表达显著下降;（3）免疫荧光结果显示,较对照组相比,老龄供肝组供肝KCs内GPR37表达显著下降;（4）HE染色结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组供肝急性排斥样改变显著改善,且RAI评分显著下降;（5）全自动生化仪检测结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组血清内ALT、AST水平显著下降;（6）TUNEL染色结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组供肝内TUNEL阳性的细胞数量显著下降,提示凋亡细胞减少;（7）免疫组化结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组供肝内i NOS阳性的KCs数量显著下降、CD163阳性的KCs数量显著增加,提示KCs M2型极化程度升高;（8）ELISA、RT-PCR检测结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组血清中IL-6、TNF-α表达水平显著下降、IL-10表达水平显著增高;（9）给予细胞松弛素D处理后,TUNEL染色结果显示,老龄过表达组肝组织内TUNEL阳性的细胞数量显著增加;（10）给予细胞松弛素D处理后,免疫组化结果显示,老龄过表达组肝组织内i NOS阳性的KCs数量显著增加、CD163阳性的KCs数量显著下降。结论:（1）老龄大鼠供肝来源的KCs中GPR37表达显著降低;（2）过表达老龄大鼠来源的KCs中GPR37,改善了肝移植后急性排斥反应程度、减轻了肝移植后肝组织内细胞凋亡水平、促进了肝组织内KCs M2型极化;（3）GPR37过表达引起的凋亡细胞减少和KCs M2型极化升高与胞葬作用有关。第二部分过表达GPR37对老龄鼠供肝Kupffer细胞M2型极化的机制研究目的:建立KCs-凋亡细胞共培养体系,从体外实验水平,进一步探讨GPR37经胞葬作用的途径促进KCs M2型极化的具体机制。方法:（1）根据改良的“三步法”,即:Ⅳ型胶原酶消化、梯度离心、选择性贴壁的方法,分离、培养肝组织KCs;（2）按照KCs来源,分为4组（n=30只/组）:对照组（Ctrl group）;老龄供肝组（Aged group）;老龄对照组（AAV-Ctrl group）;GPR37过表达组（AAV-OE group）;（3）分离脾脏T淋巴细胞,并以H2O2处理,诱导T细胞凋亡,按照1:10的比例,建立KCs-凋亡细胞共培养体系;（4）运用Western blot,检测各组KCs中caspase3、c-casepase3、Bax、Bid、CD163、CD206、i NOS、CD86的表达水平;（5）运用免疫荧光染色,检测各组KCs中PKH26、F4/80的共定位情况,CD163、F4/80的共定位情况;（6）运用Fluo-4AM标记的钙离子探针,检测各组KCs中钙离子浓度;（7）运用Western blot检测各组KCs中PI3K、AKT、p-AKT、STAT3、p-STAT的表达水平;（8）给予IPI-549或DSMO处理后,运用Western blot检测各组KCs中PI3K、AKT、p-AKT、STAT3、p-STAT的表达水平;运用免疫荧光染色检测各组KCs中STAT3入核程度,CD163、F4/80共定位情况;（9）给予GSK2141795或DSMO处理后,运用Western blot检测各组KCs中PI3K、AKT、p-AKT、STAT3、p-STAT的表达水平;运用免疫荧光染色检测各组KCs中STAT3入核程度,CD163、F4/80共定位情况;（10）给予Stattic或DSMO处理后,运用Western blot检测各组KCs中PI3K、AKT、p-AKT、STAT3、p-STAT的表达水平;运用免疫荧光染色检测各组KCs中STAT3入核程度,CD163、F4/80共定位情况。结果:（1）Western blot结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组T细胞内c-casepase3、Bax、Bid表达显著下降;在阻断胞葬作用后,老龄过表达组T细胞内c-casepase3、Bax、Bid表达显著增高;（2）免疫荧光结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组KCs内PKH26、F4/80共定位表达显著增加;在阻断胞葬作用后,老龄过表达组KCs内PKH26、F4/80共定位表达显著下降;（3）Western blot结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组KCs内i NOS、CD86表达显著下降,CD206、CD163表达显著升高;在阻断胞葬作用后,老龄过表达组KCs内i NOS、CD86表达显著升高,CD206、CD163表达显著下降;（4）免疫荧光结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组KCs内CD163、F4/80共定位表达显著增加;在阻断胞葬作用后,老龄过表达组KCs内CD163、F4/80共定位表达显著下降;（5）Fluo-4AM染色结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组KCs内钙离子浓度显著增加;在阻断胞葬作用后,老龄过表达组KCs内钙离子浓度显著下降;（6）Western blot检测结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组KCs内PI3K、p-AKT、p-STAT的表达显著增加;在BAPTA-AM阻断钙离子流动后,老龄过表达组KCs内PI3K、p-AKT、p-STAT的表达显著下降;（7）Western blot检测结果显示,抑制PI3K活性后,老龄过表达组KCs内p-AKT、p-STAT的表达显著下降;免疫荧光结果显示,抑制PI3K表达后,老龄过表达组KCs内STAT3入核程度下降,CD163、F4/80共定位程度下降;（8）Western blot检测结果显示,抑制AKT磷酸化后,老龄过表达组KCs内p-AKT、p-STAT的表达显著下降;免疫荧光结果显示,抑制AKT磷酸化后,老龄过表达组KCs内STAT3入核程度下降,CD163、F4/80共定位程度下降;（9）Western blot检测结果显示,抑制p-STAT3磷酸化后,老龄过表达组KCs内p-STAT的表达显著下降;免疫荧光结果显示,抑制p-STAT3磷酸化后,老龄过表达组KCs内STAT3入核程度下降,CD163、F4/80共定位程度下降。结论:（1）GPR37介导的KCs胞葬功能增强是其发挥凋亡清除作用所必需的,并且有利于M2型极化的增加;（2）钙依赖性的PI3K-AKT-STAT3信号通路在吞噬过程中表现出活性增强,进而促进了KCs M2极化。