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目的本实验使用特异的靶向于MDR1基因的siRNA作用于p-gp阳性表达的卵巢癌细胞株SKOV3/AR,以了解其对MDR1基因的特异性抑制作用,为探讨使用siRNA逆转耐药型卵巢癌多药耐药的可行性提供实验基础。方法1.使用带FAM荧光标记的siRNA,优化转染条件,测得转染效率。2.用靶向于GAPDH的siRNA作为阳性对照,转染SKOV3/AR细胞,观察GAPDH mRNA的变化情况,以验证整个实验流程的正确性。3.设计靶向于MDR1基因的三条siRNA,并用脂质体转染试剂分别转染SKOV3/AR细胞,使用RT-PCR检测转染后48小时MDR1mRNA的变化,并筛选出干扰效率较高的一条siRNA。4.将筛选出的siRNA转染SKOV3/AR细胞,流式细胞技术检测转染后72小时p-gp的变化情况。5.MTT法检测转染前及转染后48小时SKOV3/AR细胞对阿霉素、泰素的敏感性。结果1.荧光显微镜照片fluorescence显示当干扰片段浓度为30nM时候siRNA的转染效率最高。2.siRNA转染后48小时RT-PCR测得空白组、脂质体组及阳性对照组的GAPDH mRNA的相对表达水平分别是2.46±0.08,2.34±0.04,1.41±0.05,与空白组相比,阳性对照组GAPDHmRNA显著降低(P<0.05)。3.转染后48小时RT-PCR结果提示:siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组、空白组、脂质体组及阴性对照组MDR1mRNA的表达水平分别是1.98±0.03,2.05±0.09,1.45±0.08,3.49±0.28,3.46±0.17和3.48±0.26,同空白组相比,前三组MDR1mRNA的表达水平均有显著下降(均有P<0.05),它们对MDR1mRNA的抑制率分别是43.3%、41.3%和58.5%。根据试验结果,选择对基因抑制率较高的siRNA-3进行下一步实验。4.将siRNA-3转染细胞后72小时流式细胞仪检测空白组,脂质体组,阴性对照组,干扰组的的p-gp阳性表达率分别是(84.5±0.07)%、(85.35±0.06)%、(84.87±0.01)%、(52.43±0.07)%,与空白组相比,干扰组p-gp显著降低(p<0.05),其抑制率为37.95%,而脂质体组及阴性对照组无明显抑制作用(p>0.05)。用siRNA-3干扰SKOV3/AR细胞后,阿霉素和紫杉醇的IC50分别下降为干扰前的1/3.56和1/3。结论RNAi在体外实验能逆转卵巢癌细胞的耐药,为它在实体瘤耐药逆转的运用提供了实验依据,值得进一步研究。